THUYẾT MINH DỰ THẢO TIÊU CHUẨN QUỐC GIA Tên tiêu chuẩn Thực phẩm - Xác định hoạt tính enzym cellulase phương pháp thủy phân giấy lọc (phương pháp FPU) Tổ chức biên soạn - Tên tổ chức (cá nhân): Viện Kiểm nghiệm ATVSTP quốc gia - Địa chỉ: Số 65 Phạm Thận Duật – Cầu Giấy – Hà nội - Điện thoại: 043.9335741 (CQ) Fax: 04.39335738 - Tên quan chủ quản: Bộ Y tế Khái quát chung: 3.1 Tình hình đối tượng tiêu chuẩn nước : Cellulase phức hệ enzyme xúc tác thủy phân cellulose thành cellobiose cuối glucose Cellulase có nguồn gốc từ động vật: dịch tiết dày bị, nhóm thân mềm Cellulase có thực vật, hạt ngũ cốc nảy mầm đại mạch, yến mạch, lúa mạch, lúa mì mạch đen… Bên cạnh cellulase sinh từ nguồn vi sinh vật, loại xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm sợi nấm men… Trong thực tế người ta thu nhận enzyme cellulase từ vi sinh vật Các chủng vi sinh vật thường sử dụng nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus candidus…; xạ khuẩn: Actinomyces griseus, Streptomyces reticuli…; vi khuẩn: Acetobacter xylinum, Bacillus Subtilis, Bacillus pumilis… Cellulase phức hệ enzyme có tác dụng thủy phân cellulose thông qua việc thủy phân liên kết β-1,4-glucoside cellulose Công thức cấu tạo chất cellulose enzyme cellulase sau: Cấu trúc chất cellulose Cellulase có chất protein cấu tạo từ đơn vị axit amin, axit amin nối với liên kết peptid – CO – NH- Ngồi ra, cấu trúc cịn có phần phụ khác Cấu trúc hoàn chỉnh loại enzyme nhóm endoglucanase (EG) exo-glucanase (CBH) giống hệ cellulase nấm sợi, gồm trung tâm xúc tác đuôi tận cùng, phần đuôi xuất phát từ trung tâm xúc tác gắn thêm vùng glycosyl hóa, cuối vùng gắn kết với cellulose Vùng có vai trị tạo liên kết với cellulose tinh thể Trong q trình phân hủy cellulose có tương quan mạnh khả xúc tác phân giải cellulose enzyme lực enzyme cellulose Hơn nữa, hoạt tính cellulase dựa vào tinh thể cellulose khả kết hợp CBD với cellulose Điều chứng tỏ CBD hỗ trợ cho enzyme cellulase thực việc cắt đứt nhiều liên kết cellulose tinh thể Vùng gắn kết với cellulose có cấu tạo khác với liên kết thơng thường protein việc thay đổi chiều dài vùng glycosil hóa có ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác enzyme Enzyme cellulase chia thành loại : - Endo-β-1,4-glucanase (EC 3.2.1.4) - Exo- β -1,4-glucanase: chia thành 1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrodase (EC 3.2.1.74) 1,4-β-D-glucan cellobiohydrodase (EC.3.2.1.91) - β -glucosidase Tính chất lý hóa enzyme Endo-β-1,4-glucanase: - Enzyme hoạt động tốt pH 5,5, nhiệt độ 55 oC, bền 30 - 45oC, hoạt tính cao pH = - - Các dung mơi hữu ảnh hưởng tới enzyme này, trừ n-butanol - Các ion kim loại EDTA nồng độ 4-12 mM, làm giảm hoạt tính enzyme Nguồn thu nhận từ chủng nấm Enzyme cellulase ứng dụng cơng nghiệp, có sản phẩm bổ sung, nước uống bổ sung Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi cellulase nguồn thức ăn cung cấp lượng cho gia súc gia cầm có chứa phần polysaccharide gồm cellulose, β-glucan chất chứa cầu nối β-1,4 glucoside làm tăng độ nhớt ruột Vì thế, việc bổ sung cellulase trực tiếp vào thức ăn làm tăng khả đồng hóa thực phẩm đường tiêu hóa động vật, tăng khả hấp thu chuyển hóa thức ăn động vật Trong công nghiệp sản xuất rượu, cellulase bổ sung vào để đẩy nhanh tốc độ tiếp xúc tinh bột với amylase, dẫn tới hiệu suất thu hồi rượu tăng 3.2 Một số phương pháp xác định hoạt độ enzyme Cellulase: Thủy phân cellulose phải có tham gia loại enzyme cellulase Thiếu loại enzyme khơng thể thủy phân phân tử cellulose đến Từ nghiên cứu riêng lẻ enzyme đến nghiên cứu tác động tổng hợp loại enzyme cellulose, nhiều nhà khoa học đưa kết luận chung loại enzyme cellulose thay phiên phân hủy cellulose để tạo thành sản phẩm cuối glucose Hoạt độ enzyme cellulase xác định theo phương pháp định lượng đường khử Nelson/Samogi Trong đó, đơn vị hoạt độ lượng enzyme phân giải chất CMC thành đường khử tương tương đương µl glucose thời gian phút điều kiện thí nghiệm Theo hướng dẫn Hiệp hội hóa học ứng dụng hóa học quốc tế (IUPAC), quy trình thiết kế để đo hoạt tính cellulase sử dụng chất giấy lọc, đơn vị FPU cho mililit dung dịch enzyme ban đầu Trong Enzyme cellulase phân hủy chất cellulose dạng giấy lọc Whatman No.1 tạo glucose, lượng glucose tạo xác định cách so sánh với đường chuẩn glucose cách lập đường chuẩn glucose xây dựng mối quan hệ tuyến tính nồng độ glucose độ hấp thụ quang Kết định lượng enzyme chế phẩm so sánh sở chuyển đổi cân có ý nghĩa Phương pháp đưa cách xác định hoạt tính enzyme cellulase dễ thực tính ứng dụng cao phịng thí nghiệm Đây sở khoa học để thực hoạt động xây dựng dự thảo TCVN Sự cần thiết việc xây dựng tiêu chuẩn Hiện vấn đề kiểm soát chất lượng sản phẩm quan tâm, việc xây dựng phương pháp chuẩn làm công cụ giúp quan chức kiểm soát đánh giá chất lượng sản phẩm cần thiết Hơn nữa, Việt Nam chưa có phương pháp tiêu chuẩn để xác định hoạt tính enzyme Cellulase thực phẩm ứng dụng phân tích phịng thí nghiệm Vì phương pháp xây dựng phù hợp với điều kiện sẵn có phịng thí nghiệm với độ nhạy, độ ấn đề chất lượng an toàn thực phẩm mối quan tâm toàn xã hội Phương thức xây dựng tài liệu làm xây dựng TCVN: - Phương thức thực hiện: Trên sở rà soát tiêu chuẩn Việt nam quốc tế phương pháp phân tích hoạt độ enzyme Cellulase tham khảo phương pháp xây dựng tiêu chuẩn/quy chuẩn, nhóm xây dựng khuyến nghị biên soạn tiêu chuẩn theo phương pháp chấp thuận nguyên vẹn (có chỉnh sửa thể thức trình bày theo qui định trình bày Tiêu chuẩn Quốc gia) - Tài liệu làm xây dựng TCVN: Dự thảo xây dựng sở Pure and Application of chemistry Vol.59, No.2, pp, 257-268,1987 (IUPAC): Measurement of Cellulase Activity Nội dung dự thảo tiêu chuẩn Dự thảo xây dựng với nội dung sau: Lời nói đầu Phạm vi áp dụng Nguyên tắc Thuốc thử Thiết bị, dụng cụ Lấy mẫu Cách tiến hành Tính kết Báo cáo thử nghiệm Thuyết minh số nội dung: Bảng đối chiếu tiêu chuẩn viện dẫn Nội dung Tài liệu viện dẫn tiêu chuẩn IUPAC Tham khảo TCVN xây Lời nói đầu dựng dựa AOAC Tự biên soạn dựa nội dung Phạm vi áp dụng phương pháp Tự biên soạn dựa nội dung Nguyên tắc Thuốc thử Thiết bị dụng cụ Lấy mẫu Sửa đổi, bổ sung Chemicals and Reagent Apparatus phương pháp Chấp thuận nguyên vẹn Chấp thuận nguyên vẹn Tự biên soạn dựa quy định Nội dung Tài liệu viện dẫn tiêu chuẩn IUPAC Sửa đổi, bổ sung xây dựng TCVN Procedure for the Cách tiến hành Tính kết Filter Paper Assay for Saccharifying Cellulase Calculations Chấp thuận nguyên vẹn Chấp thuận nguyên vẹn Tự biên soạn, tham khảo Báo cáo thử TCVN phương pháp kiểm nghiệm nghiệm thực phẩm Kết luận: Dự thảo hoàn toàn tương đương với tài liệu IUPAC đáp ứng yêu cầu xây dựng TCVN Hà Nội, ngày tháng năm 2019 TM Ban soạn thảo ... TCVN: Dự thảo xây dựng sở Pure and Application of chemistry Vol.59, No.2, pp, 257-268,1987 (IUPAC): Measurement of Cellulase Activity Nội dung dự thảo tiêu chuẩn Dự thảo xây dựng với nội dung... Đây sở khoa học để thực hoạt động xây dựng dự thảo TCVN Sự cần thiết việc xây dựng tiêu chuẩn Hiện vấn đề kiểm soát chất lượng sản phẩm quan tâm, việc xây dựng phương pháp chuẩn làm công cụ giúp... cáo thử nghiệm Thuyết minh số nội dung: Bảng đối chiếu tiêu chuẩn viện dẫn Nội dung Tài liệu viện dẫn tiêu chuẩn IUPAC Tham khảo TCVN xây Lời nói đầu dựng dựa AOAC Tự biên soạn dựa nội dung Phạm