Nghiên cứu này giới thiệu một quy trình tách chiết DNA nhanh và hiệu quả từ phương pháp CTAB cải tiến, từ đó, áp dụng vào phản ứng PCR khuếch đại vùng trình tự matK của loài Limnocharis flava nhằm xác định vị trí phân loại của họ Limnocharitaceae. Kết quả cho thấy, trình tự của sản phẩm PCR được khuếch đại từ DNA tổng được tách chiết bằng phương pháp CTAB cải tiến cho kết quả có độ tin cậy cao.
Chuyên san Phát triển Khoa học Công nghệ số (1), 2018 XÁC ĐỊNH VỊ TRÍ PHÂN LOẠI CỦA HỌ LIMNOCHARITACEAE BẰNG DỮ LIỆU PHÂN TỬ DỰA TRÊN DNA TỔNG TỪ QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT NHANH Huỳnh Nữ Băng Thùy, Nguyễn Anh Đức, Trình Trung Hiếu, Võ Tuấn Dũng, Văn Hồng Thiện* Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm – Trường Đại học Công nghiệp TP.HCM *Tác giả liên lạc: vanhongthien@iuh.edu.vn (Ngày nhận bài: 22/12/2017; Ngày duyệt đăng: 22/3/2018) TÓM TẮT Nghiên cứu giới thiệu quy trình tách chiết DNA nhanh hiệu từ phương pháp CTAB cải tiến, từ đó, áp dụng vào phản ứng PCR khuếch đại vùng trình tự matK lồi Limnocharis flava nhằm xác định vị trí phân loại họ Limnocharitaceae Kết cho thấy, trình tự sản phẩm PCR khuếch đại từ DNA tổng tách chiết phương pháp CTAB cải tiến cho kết có độ tin cậy cao Ngồi ra, phân tích phả hệ cho thấy, loài thuộc họ Limnocharitaceae xếp gọn bên loài thuộc họ Alismataceae, từ khẳng định lại vị trí phân loại họ Limnocharitaceae Từ khóa: Tách chiết DNA, limnocharis flava, limnocharitaceae, alismataceae TAXONOMIC IDENTITY OF LIMNOCHARITACEAE BASED ON MOLECULAR DATA FROM A RAPID DNA EXTRACTION PROTOCOL Huynh Nu Bang Thuy, Nguyen Anh Duc, Trinh Trung Hieu, Vo Tuan Dung, Van Hong Thien* Institute of Biotechnology and Food Technology – Industrial University of Ho Chi Minh City *Corresponding Author: vanhongthien@iuh.edu.vn ABSTRACT In this study, we used a rapid and effective DNA extraction protocol which are modified from CTAB method to amplify matK sequence of Limnocharis flava for determination of taxonomic position of Limnocharitaceae family The data demonstrated that the matK sequence amplified by this protocol had high reliability Furthermore, phylogenetic analysis revealed that species of Limnocharitaceae nested in Alismataceae family, and thus taxonomic position of Limnocharitaceae family was re-classified Keywords: DNA extraction, limnocharis flava, limnocharitaceae, alismataceae Limnocharitaceae vào họ Alismataceae (www.theplantlist.org) Tuy nhiên, Việt Nam, Phạm Hoàng Hộ (2000) cho rằng, Limnocharitaceae họ riêng biệt gồm lồi Limnocharis flava Tenagocharis latifolia Do đó, đề tài nghiên cứu cung cấp thêm liệu phân tử (vùng trình tự matK gen lục lạp) nhằm góp phần xác định vị trí phân lồi họ Limnocharitaceae (với đại diện TỔNG QUAN Limnocharitaceae họ thực vật với số lượng lồi (Phạm Hồng Hộ, 2000) Theo chứng phơi, sinh hóa phân tử cho thấy, họ Limnocharitaceae có mối quan hệ gần với họ Alismataceae (Donald and Nicholas, 2013) nay, hệ thống thông tin thực vật Vườn thực vật Hoàng gia Anh (Kew) nhập họ 76 Chuyên san Phát triển Khoa học Công nghệ số (1), 2018 phút (3 phút đảo đều); (3) Bổ sung 800 µl chloroform : isoamyl alcohol (24 : 1), đảo đều; (4) Ly tâm 13000 vòng 10 phút 4ºC, thu dịch sang eppendorf khác; (5) Thêm 800 µl isopropanol, đảo nhẹ, để ủ tủ -20ºC 30 phút; (6) Ly tâm 13000 vòng 10 phút 4ºC, loại bỏ dịch thu tủa; (7) Thêm 800 µl ethanol 70%, ly tâm 13000 vịng 10 phút 4ºC thu tủa; (8) Để khô tủa 15-25 phút, thêm 50 µl dung dịch TE bảo quản -20ºC Phương pháp PCR Vùng trình tự matK gen lục lạp khuếch đại cặp mồi theo Fazekas et al (2012) Phản ứng PCR thực máy Mastercycler (hãng Eppendorf, Đức) với thành phần sau: 12,5 µl Go Taq Green Master Mix (hãng Promega, Mỹ), 1,25µl mồi xi ngược (10 µM), µl nước khử ion µl DNA mẫu Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR gồm: phút 95°C; 35 chu kỳ gồm: biến tính (1 phút 94°C), bắt cặp (1 phút 30 giây 55oC) kéo dài (1 phút 30 giây 72°C); kéo dài 72°C 10 phút Sản phẩm PCR tin giải trình NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG tự Công ty Nam Khoa, quận 7, TP.HCM PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên vật liệu Phương pháp xây dựng phát sinh loài Mẫu Limnocharis flava thu huyện Kết giải trình tự chiều kiểm tra Bến Lức, tỉnh Long An với cá thể (ký độ xác mắt với hỗ trợ hiệu mẫu L1, L2, L3) phần mềm FinchTV Seaview Các trình tự gióng phần mềm Phương pháp nghiên cứu ClustalX2.1 (Thompson et al., 1994), ghi Phương pháp tách chiết DNA tổng số (1) Khử mẫu với cồn 70% ; (2) Nghiền nhận khoảng cách di truyền xây dựng 200mg mẫu 1000 µl dung dịch phả phát sinh lồi mẫu nghiên cứu đệm tách chiết (NaCl 1.5M, Tris-HCl (pH trình tự từ Genbank (Bảng 1) 8,0) 100 mM; EDTA (pH 8,0) 20 mM, phần mềm MEGA6 (Tamura et al., 2013) CTAB 4%) (tăng hiệu thành công theo phương pháp Neighbor Joning với mẫu chuyển thành dạng bột với Nitơ nhóm ngoại lồi Limnobium spongia lỏng), vortex mạnh ủ 60ºC 15 (Donald and Nicholas, 2013) Bảng Trình tự taxa từ liệu GenBank sử dụng nghiên cứu STT Tên loài Mã số STT Tên loài Mã số GenBank GenBank Albidella EF088125 14 Echinodorus EF088117 nymphaeifolia decumbens loài L flava) Hiện nay, việc ứng dụng thị phân tử nghiên cứu phân loại học thực vật trở nên phổ biến giới (Palmer et al., 2004) Việt Nam (Văn Hồng Thiện, 2017) Để thành công phản ứng PCR phần cơng việc quan trọng tách chiết DNA tổng số Hiện tại, hầu hết nghiên cứu có liên quan đến q trình tách chiết DNA tập trung vào phương pháp: (1) sử dụng kít chuyên dụng (2) phương pháp CTAB Phương pháp có ưu điểm cho kết nhanh, DNA tinh sạch, nhiên chi phí lại cao Ngược lại, phương pháp CTAB tốn quy trình thực phức tạp thường thời gian Do vậy, khuôn khổ báo này, giới thiệu quy trình tách chiết DNA nhanh từ phương pháp CTAB có cải tiến quy trình chuẩn dung cho phản ứng PCR từ phương pháp Sản phẩm DNA tổng số sau tách chiết đưa vào thực phản ứng PCR mà không cần phải qua bước định tính hay định lượng 77 Chuyên san Phát triển Khoa học Công nghệ số (1), 2018 Alisma gramineum KX526478 15 Alisma lanceolatum HM850585 16 Alisma nanum JF781066 17 HM850587 18 Baldellia ranunculoides Butomopsis latifolia HQ456459 19 Burnatia enneandra Caldesia grandis Caldesia oligococca JN547814 JF781068 KF632791 20 21 22 10 Damasonium alisma JF781070 23 11 Damasonium minus JF781069 24 12 Echinodorus berteroi Echinodorus cordifolius EF088134 25 KF632792 26 13 Helanthium bolivianum Helanthium zombiense Hydrocleys nymphoides Limnocharis flava KF632794 Limnophyton angolense Luronium natans Ranalisma humile Ranalisma rostratum Sagittaria graminea Sagittaria guayanensis Wiesneria triandra Limnobium spongia JF781076 EF088120 AB002580 HQ456464 JN894192 HQ456466 JF781078 JF781084 JF781081 HQ535983 HQ456471 900 bp so với thang chuẩn Kết phù hợp với kích thước lý thuyết cặp mồi Fazekas et al., (2012) thiết kế mà sử dụng cho đề tài nghiên cứu KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết khuếch đại trình tự vùng matK Kết thể Hình cho thấy, sản phẩm PCR cá thể nghiên cứu sáng rõ, kích thước nằm vạch 800 Hình Kết PCR cá thể loài L flava Như vậy, phản ứng PCR thực xác sản phẩm PCR cho dựa mẫu DNA tổng số vừa phân tích tiếp theo, chúng tơi cho ngẫu thực theo quy trình tách nhanh mà nhiên sản phẩm để giải trình tự (mẫu L2) cải tiến từ phương pháp CTAB Trình tự DNA mẫu nghiên cứu sau cho kết tốt Để khẳng định tính hiệu chỉnh kết hợp với liệu 78 Chuyên san Phát triển Khoa học Công nghệ số (1), 2018 từ GenBank để xây dựng phát sinh loài nhằm xác định mối tương quan họ Limnocharitaceae Alismataceae Kết xây dựng phả hệ Kết phân tích đặc điểm trình tự taxa nghiên cứu cho thấy, trình tự vùng matK taxa dao động khoảng từ 750 đến 769 bp Các trình tự sau gióng có chiều dài 704 đến 742 bp Trình tự matK mẫu nghiên cứu (L2) có tỉ lệ A + T 68%, có vị trí thêm đoạn (insertion) so với nhóm ngoại vị trí từ 52 đến 60 Hình Cây phát sinh loài thể mối quan hệ di truyền họ Limnocharitaceae Alismataceae dựa vùng trình tự matK xây dựng dựa mẫu nghiên cứu (L2) taxa từ liệu GenBank phần mềm MEGA6, phương pháp Neighbor Joning, bootstrap 1.000 lần lặp lại Cây phát sinh lồi thể Hình cho L flava (HQ456464) khơng có khác thấy, mẫu nghiên cứu (L2) xếp chung biệt đó, chúng có khoảng cách nhóm với lồi Limnocharis flava (mã số di truyền (Bảng 2) Như vậy, từ kết GenBanK HQ456464) với bootstrap chứng minh rằng, mẫu 100% Ngoài ra, xét tồn trình tự nghiên cứu PCR từ DNA tổng số vùng matK cho thấy mẫu L2 lồi hồn tồn xác 79 Chun san Phát triển Khoa học Công nghệ số (1), 2018 Bảng Khoảng cách di truyền mẫu nghiên cứu (L2) taxa thuộc họ Alismataceae Albidella nymphaeifolia Burnatia enneandra 0.052 Limnocharis flava 0.082 0.081 (HQ456464) Limnocharis flava (L2) 0.082 0.081 0.000 Hydrocleys nymphoides 0.049 0.049 0.054 0.054 Butomopsis latifolia 0.071 0.077 0.074 0.074 0.049 Caldesia grandis 0.065 0.074 0.079 0.079 0.060 0.074 Limnophyton angolense 0.084 0.082 0.104 0.104 0.077 0.084 0.087 Ngoài ra, phát sinh lồi (Hình 2) cho thấy, loài thuộc họ Limnocharitaceae gồm (L flava, H nymphoides B latifolia) xếp xếp gọn bên lồi thuộc họ Alismataceae Theo đó, khoảng cách di truyền loài L flava, H nymphoides B latifolia so với lồi thuộc họ Alismataceae cịn thấp khoảng cách loài họ Alismataceae với nhau, chẳng hạn, L flava, H nymphoides B latifolia có khoảng cách di truyền so với loài Caldesia grandis 0,079 0,060 0.74 Trong đó, lồi Limnophyton angolense có khoảng cách di truyền so với Caldesia grandis lên đến 0,087 (Bảng 2) Kết phù hợp với nghiên cứu gần thị phân tử họ Alismataceae, kết nghiên cứu cho thấy, loài L flava (họ Limnocharitaceae) ln có mối quan hệ gần mặt di truyền so với taxa thuộc họ Alismataceae Chẳng hạn, Donald and maryke (1997) xây dựng phát sinh loài dựa vùng mã hóa (coding) gen lục lạp cho loài thủy sinh cho thấy rằng, loài thuộc họ Limnocharitaceae (gồm L flava H nymphoides) có mối quan hệ di truyền gần với họ Alismataceae Tương tự, Donald and Nicholas (2013) kết hợp vùng gen lục lạp (matK rbcL) nhân (nrITS) cho thấy, loài thuộc họ Limnocharitaceae xếp gọn bên họ Alismataceae phát sinh loài KẾT LUẬN Kết nghiên cứu giới thiệu quy trình tách chiết DNA nhanh tốn chi phí so với phương pháp Ngồi liệu phân tử, nghiên cứu góp phần xác định lại vị trí phân loại họ Limnocharitaceae TÀI LIỆU THAM KHẢO DONALD, H L., & MARYKE, A C (1997) Phylogenentic studies in Alismatideae, II: Evulution of Marine Angiosperms (Seagrasses) and Hydrophily Systematic Botany, 22(3), 443-463 FAZEKAS, A J., KUZMINA, L., NEWMASTER, S G., & HOLLINGSWORTH, P M (2012) DNA Barcoding methods for land plants In: W.J Kree, D.L Erickson (ed) DNA Barcodes: Method and Protocols Meth Mol Biol, 858, 223-252 PHẠM HOÀNG HỘ (2000) Cây cỏ Việt Nam, tập NXB Trẻ VĂN HỒNG THIỆN, NGUYỄN PHIA NGÀ, LƯU HỒNG TRƯỜNG (2015) Homalomena cochinchinensis (họ Araceae): Thử nghiệm marker phân tử phân tích số thành phần hóa học Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 13(4A), 1329-1334 80 ... CTAB tốn quy trình thực phức tạp thường thời gian Do vậy, khuôn khổ báo này, giới thiệu quy trình tách chiết DNA nhanh từ phương pháp CTAB có cải tiến quy trình chuẩn dung cho phản ứng PCR từ phương... loài thuộc họ Limnocharitaceae xếp gọn bên họ Alismataceae phát sinh loài KẾT LUẬN Kết nghiên cứu giới thiệu quy trình tách chiết DNA nhanh tốn chi phí so với phương pháp Ngoài liệu phân tử, nghiên... dựa mẫu DNA tổng số vừa phân tích tiếp theo, chúng tơi cho ngẫu thực theo quy trình tách nhanh mà nhiên sản phẩm để giải trình tự (mẫu L2) chúng tơi cải tiến từ phương pháp CTAB Trình tự DNA mẫu