Xây dựng kit PCR phát hiện sự tạp nhiễm thành phần có nguồn gốc từ heo và gà trong thực phẩm chay

Mục đích của nghiên cứu này là xây dựng kit PCR phát hiện sự tạp nhiễm thành phần có nguồn gốc từ động vật và áp dụng quy trình vào kiểm tra tính thuần chay của một số mẫu thực phẩm chay trên thị trường.

Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 67 XÂY DỰNG KIT PCR PHÁT HIỆN SỰ TẠP NHIỄM THÀNH PHẦN CÓ NGUỒN GỐC TỪ HEO VÀ GÀ TRONG THỰC PHẨM CHAY (ESTABLISHMENT OF PCR KIT FOR DETECTION OF ADULTERY FROM PORK AND CHICKEN IN VEGETARIAN FOOD) Trần Kiến Đức, Phan Thị Trâm, Lê Thị Ngọc Châu Khoa Công nghệ sinh học, Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh SUMMARY “Veganicity”, meant it not contain any ingredients which have origin from animals is an important feature in the processing and manufacturing of vegetarian foods However, checking veganicity in product is the great challenge that has no any concrete assay to find out whether the presence of ingredients animal in vegetarian food For purpose to check whether or not the presence of animal ingredients in vegetarian food, initiallly established PCR kit for detection of adultery from pork and chicken in vegetarian food based on the amplification of mitochondrial 16S rDNA, which was specific to animal species, by TP1 and TP2 primers Stimultaneously, the internal control was carried out by amplication of a noncoding region of chloroplast DNA genome by specific primer CLO1 and CLO2 The methodologic of these PCR kit was executed from in silico survey to in vitro The initial experiment was carried out on 23 samples, which were collected from local market and many vegeterian food companies As the results, 9/23 samples (counting for 39.13%) were detected as containing of the animal ingredients that are controled with the internal control, positive control and negative control From the experimental results, we confirmed that initially succeeded in establishment of PCR kit to aplly detecting the presence of ingredients animal in vegetarian food Keywords: 16S rDNA mitochondrial, animal, chloroplast DNA, PCR, plant, vegetarian food MỞ ĐẦU Thực phẩm chay hiểu thực phẩm khơng chứa thành phần có nguồn gốc từ động vật Thuật ngữ “ăn chay” biết đến nhiều đạo Phật nhiều tôn giáo khác với nhiều hình thức “ăn chay” khác Hiện nay, xu hướng ăn chay ngày gia tăng nhiều quốc gia giới Việt Nam Lý gia tăng ăn chay xuất phát từ nhiều quan niệm khác nhau, chẳng hạn như: ăn chay phương thức việc phòng chống bệnh tật nguy hiểm liên quan đến tim mạch, cao huyết áp, ung thư; hay quan niệm tôn giáo… Nắm bắt xu phát triển, nhu cầu thị hiếu người sử dụng, thị trường thực phẩm chay ngày phát triển với nhiều mẫu mã thực phẩm chay đa dạng, phong phú như: thịt gà chay, heo chay, bò viên chay,… Một vấn đề quan tâm trình chế biến, sản xuất thực phẩm chay “tính chay” Tính chay hiểu thực phẩm chay không nhiễm thành phần có nguồn gốc từ động vật Tuy nhiên, tính chay có đảm bảo q trình chế biến hay không vấn đề, thách thức thị trường thực phẩm chay Đặc biệt, công ty sản xuất, xuất thực phẩm chay đặc tính đóng vai trị định Hơn nữa, nước việc kiểm tra tính chay chưa có quy trình phát hay quan có thẩm quyền đảm nhận Do đó, số cơng ty thực phẩm chay với mục đích để đảm bảo “thương hiệu” phải gửi mẫu thực phẩm (sản phẩm và/hoặc nguyên liệu sản xuất) sang nước để kiểm định Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên, việc nghiên cứu Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 phát triển quy trình, kit nhằm kiểm định diện có thành phần có nguồn gốc từ động vật thực phẩm chay cần thiết Trên giới, phương pháp PCR (polymerase chain reaction) phương pháp thông dụng nhiều tác giả sử dụng để khuếch đại trình DNA đích thành phần có nguồn gốc từ động vật Một số trình tự đích sử dụng gen Cytochrome b gen ty thể, 12S rDNA ty thể, 16S rDNA ty thể…Trong nghiên cứu này, 16S rDNA ty thể chọn làm trình tự DNA đích cho phản ứng PCR, lý cho lựa chọn (1) 16S rDNA có tính phổ qt, tính bảo tồn cao loài, chúng thay đổi chậm theo thời gian; (2) Số lượng nhiều 16S rDNA tế bào…Bên cạnh đó, vùng gen khơng mã hóa 68 lục lạp sử dụng làm chứng nội kiểm sốt q trình phản ứng PCR Chứng nội IAC (Internal Amplification Control)là thành phần quan trọng kit PCR, chứng nội sử dụng để chứng minh PCR không bị ức chế yếu tố, thành phần thực phẩm, bắt buộc phải xuất mẫu thực phẩm chay mẫu đối chứng âm (thực vật), sử dụng chứng nội nhằm mục đích kiểm sốt âm tính giả (kết thật âm tính bắt buộc phải có diện vạch sản phẩm chứng nội điện di) nhằm tăng cao độ xác kết Mục đích nghiên cứu xây dựng kit PCR phát tạp nhiễm thành phần có nguồn gốc từ động vật áp dụng quy trình vào kiểm tra tính chay số mẫu thực phẩm chay thị trường VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Các mẫu động vật, thực vật số mẫu thực phẩm chay thu thập ngẫu nhiên từ công ty sản xuất thực phẩm chay công ty thực phẩm chay Âu Lạc, từ chợ Thủ Dầu Một siêu thị Thiết kế mồi Trình tự mồi TP1-TP2 thiết kế bắt cặp đặc hiệu trình tự gen 16S rDNA ty thể loài động vật thu thập từ ngân hàng Genbank (NCBI: http://ncbi.nlm.nih.gov) phần mềm trực tuyến Primer3 (v.0.4.0) (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0), Annhyb Mồi CLO1 CLO2 sử dụng làm chứng nội, thu thập từ nghiên cứu Taberlet P cs (1991), cặp mồi bắt cặp đặc hiệu với trình tự gen khơng mã hóa lục lạp Mồi sau thu thập thiết kế đánh giá thông số vật lý độ dài, nhiệt độ nóng chảy, %GC, lượng hình thành cấu trúc bậc hai…bằng phần mềm trực tuyến IDT (http://sg.idtdna.com/analyzer/Applications/ OligoAnalyzer) Đồng thời tính đặc hiệu cặp mồi kiểm tra chương trình BLAST ( http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) Tách chiết DNA DNA tách chiết theo phương pháp Phenol-Chloroform có biến đổi pH = thành pH = Các mẫu trước tiến hành tách chiết DNA, mẫuđược rửa cắt giã nhuyễn thành mẫu đồng Lấy 2,0 g mẫu dịch huyền phù với mL dung dịch đồng mẫu (NaCl 5M, Tris- HCl 1M, EDTA 0.5M, ddH2O) Sau đồng nhất, hút 750 µL dịch chuyển vào ống eppendorf mới, bổ sung 20 µL SDS 10% 20 µL proteinase K (1 mg/mL), ủ qua đêm nhiệt độ 65°C Sau đó, 250 µL NaCl bão hòa bổ sung, ủ mẫu 4°C 30 phút, đem ly tâm 10.000 vòng/phút 15 phút Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 69 Chuyển 500 µL dịch vào ống eppendorf bổ sung 500 µL hỗn hợp phenol:chloroform:isoamylalkohol (25:41:1) đảo nhẹ ống, ly tâm 13.000 vòng/phút 10 phút (lặp lại 2-3 lần), thêm 500 µL Chloroform, đảo nhẹống ly tâm 13.000 vịng/phút 10 phút Q trình tủa thực với NH4OAc Isopropanol nhiệt độ -20°C vòng Sau đó, tiến hành ly tâm thu tủa lưu giữ DNA dung dịch TE cho thí nghiệm sau Nồng độ DNA xác định thông qua phương pháp đo OD kiểm tra độ tinh mẫu thông qua trị sốA260/A280 Phản ứng PCR Phản ứng PCR thực với chu trình nhiệt sau: chu kỳ với nhiệt độ 95°C phút; 35 chu kỳvới nhiệt độ95°C 30 giây, 67°C phút, 72°C phút; chu kỳ 72°C phút, 4°C tới ∞ Thành phần phản ứng PCR thể Bảng Sản phẩm PCR điện di gel agarose 1,5% giải trình tự cơng ty Nam Khoa Bảng Thành phần chu trình nhiệt phản ứng PCR Lượng (µL) Thành phần Phản ứng PCR Multiplex PCR Master mix (2X) 7.5 7.5 Mồi TP1(10 µM) 0.5 0.5 MồiTP2 (10 µM) 0.5 0.5 Mồi CLO1 0.5 Mồi CLO2 0.5 DNA khuôn 1.0 1.0 ddH2O 5.5 4.5 Tổng thể tích 15.0 15.0 Chu trình nhiệt Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 70 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Khảo sát đặc tính mồi sử dụng nghiên cứu Các đặc tính vật lý mồi đánh giá phần mềm IDT thể Bảng Bảng Các đặc tính vật lý mồi TP1-TP2 CLO1-CLO2 Chiều Trình tự (5’ - 3’) %GC Tm(°C) (1) (2) dài Mồi TP1 CCYAGGGATAACAGC GCAATC 21 54,7 55,5 0,81 (3) 1,47 1,5 TP2 CLO1 TCCGGTCTGAACTCAG ATCAC GGTTCAAGTCCCTCTA TCCC 21 52,4 56.2 20 54,4 55 - - 2,00 1,34 0,36 3,07 8,7 CLO2 ATTTGAACTGGTGACA CGAG 20 52,8 45 - - 0,32 3,61 Ghi chú: (1): mức lượng liên kết tự cho khả hình thành cấu trúc hairpin loop (kcal/mole) (2): mức lượng liên kết tự cho khả hình thành cấu trúc selfdimer (kcal/mole) (3): mức lượng liên kết tự cho khả hình thành cấu trúc heterodimer (kcal/mole) Dựa kết Bảng 2, giá trị vật lý chiều dài, %GC, nhiệt độ nóng chảy (Tm) chênh lêch nhiệt độ nóng chảy (∆Tm) thỏa mãn yêu cầu thiết kế mồi Về giá trị ΔG phần lớn thỏa mãn lớn -9 Kcal/mol, ngoại trừ lượng hình thành cấu trúc tự bắt cặp mồi TP1-TP2 Tuy nhiên, tiến hành kiểm tra phần mềm trực tuyến IDT, cấu trúc tự bắt cặp xảy đầu 5’ giá trị không chênh lệch nhiều so với yêu cầu Do đó, cặp mồi sử dụng kiểm tra tính đặc hiệu Tính đặc hiệucủa cặp mồi kiểm tra chương trình BLAST, kết cho thấy hai cặp mồi bắt cặp đặc hiệu với trình tự gen đích, độ bao phủ đạt 100%, giá trị E-value, Max Score, Total Score, Ident đạt độ in cậy cao Đồng thời, khả bắt cặp mồi xác định chương trình Annhyb ClustalX, kết cho thấy cặp mồi TP1-TP2 bắt cặp đặc hiệu với gen 16S rDNA ty thể động vật, kích thước sản phẩm khuếch đại 154 bp, cặp mồi CLO1-CLO2 bắt cặp đặc hiệu với trình tự gen khơng mã hóa lục lạp, kích thước sản phẩm khuếch đại 426 bp Dựa kết thu nhận được, cặp mồi TP1-TP2 CLO1-CLO2 chọn để sử dụng cho cácnghiên cứu thực nghiệm sau Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 71 (A) (B) (C) Hình (A) Sự bắt cặp TP1 TP2 lên trình tự 16S rDNA Sus scrofa (Mã số truy cập Genbank: KC208030) Vị trí Y cặp mồi TP1 tương thích với nucleotide C trình tự bắt cặp; Kết BLAST (B) cặp mồi TP1 (C) TP2 thể tính đặc hiệu mồi Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 72 (A) (B) (C) Hình (A) Sự bắt cặp CLO1 CLO2 lên trình tự DNA khơng mã hóa Lactuca sativa(Mã số truy cập Genbank: AP007232); Kết BLAST (B) cặp mồi CLO1 (C) CLO2 thể tính đặc hiệu cặp mồi Kết kiểm tra 23 mẫu thực phẩm chay thị trường Khảo sát 23 mẫu thực phẩm chay thị trường (12 mẫu thực phẩm chay từ siêu thị, mẫu thu thập từ chợ Thủ Dầu Một tỉnh Bình Dương, mẫu công ty thực phẩm chay Âu Lạc, mẫu thực phẩm chay từ quán cơm chay Thủ Dầu Một) mẫu động vật (heo, gà) làm đối chứng dương, mẫu thực vật (cải bắp) làm đối chứng âm Kết điện di thể hình Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 73 (A) Chú thích: 1, 2, 3, 4, 5: mẫu thực phẩm chay từ công ty Âu Lạc (thứ tự:đùi gà xả chay, thịt nạc kho chay, sườn ram chay, bò kho chay, pate gan ngỗng chay) 6, 7, 8: mẫu thực phẩm chay từ quán cơm chay Thủ Dầu Một(thứ tự mẫu: heo chiên chay, chả trứng vịt chay, chả cá chay) 12, 13, 14: mẫu thực phẩm chay từ chợ Thủ Dầu Một (thứ tự: gà cục chay, bột xù, thịt gà xé chay) 9: Mẫu động vật (thịt heo) 10: mẫu thực vật (cải bắp) Mẫu động (B) Chú thích:1, 2, 3, 4, 5, 6: Lúa mạch nâu hạt, lúa mạch vàng khúc, Amila vàng lát nhỏ, Amila bạch kê cục, bột nêm bào ngư, bột nêm gà chay.7: Động vật (heo) 8: Mẫu trộn heo: cải (tỉ lệ 1:1).TV: thực vật (cải).Chứng (): không DNA vật (thịt heo) 11: Mẫu động vật (thịt gà) 15: mẫu hỗn hợp (tỉ lệ heo:gà:thực vật: 1:1:1) 16, 17, 18, 19, 20:mẫu hỗn hợp (thực phẩm chay Âu Lạc:động vật (heo) theo tỷ lệ 3:1) 21, 22, 23: Mẫu hỗn hợp (thực phẩm chay từ chợ Thủ Dầu Một:động vật (heo) theo tỷ lệ 3:1) 24, 25, 26: Mẫu hỗn hợp (nguồn cung cấp ngoài:động vật (heo) theo tỷ lệ 3:1) M: Thang chuẩn 100 bp (C) Chú thích:1, 2, 3, 4, 5, 6: Bột nêm gà chay 1, bột nêm gà chay 2, bạch kim kê, burger tiêu đen, dăm chay, chả lụa Vegan ĐV: Động vật (heo) 7: Mẫu trộn heo: cải (tỉ lệ 1:1).TV: thực vật (cải).Chứng (-): khơng DNA Hình Kết kiểm tra tạp nhiễm thành phần động vật mẫu thực nghiệm Tổng số mẫu phát chứa DNA động vật 9/23 mẫu (39,13%) có mẫu từ siêu thị, mẫu từ quán cơm chay mẫu từ thị trường chợ Thủ Dầu Một tỉnh Bình Dương.Các giếng có xuất vạch sản phẩm 154 bp DNA động vật Độ sáng không đồng vạch mẫu bị nhiễm giải thích hàm lượng DNA động vật nhiễm mẫu khác nhau, nồng độ DNA tách không giống nhau, dẫn đến khuếch đại vạch có độ sáng khác Đối với mẫu chứng dương hoàn toàn xuất vạch với kích thước 154 bp sáng, mẫu chứng âm khơng xuất hiệnvạch sản phẩm 154 bp.Để xác định mẫu nhiễm DNA loài nào, sản phẩm PCR mẫu Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 74 chọn đại diện để giải trình tự cơng ty Nam Khoa (mẫu 8-Hình 3A) Hình Kết giải trình tự mạch xuôi (mồi TP1) sản phẩm PCR mẫu Dựa vào kết giải trình tự (hình 4), chúng tơi xác định lồi nhiễm mẫu nghi ngờ chứa DNA động vật tương đồng với trình tự gen ty thể lồi gà Gallus gallus với mã số truy cập KF981434 cho thấy mẫu bị nhiễm gà trình chế biến (Dữ liệu khơng trình bày) Kết kiểm tramột số mẫu thực phẩm chay với phương pháp Multi-PCR (kết hợp cặp mồi chứng nội) Áp dụng quy trình multiPCR với cặp mồi TP1-TP2 đặc hiệu cho vùng gen 16S rDNA động vật cặp mồi CLO1-CLO2 khuếch đại đặc hiệu cho vùng gen khơng mã hóa lục lạp sử dụng làm chứng nội Khảo sát thực mẫu thực vật, mẫu động vật mẫu thực phẩm chay thị trường Hình Kết kiểm tra số mẫu trị trường Multi-PCR Chú thích: 1: Lúa mạch nâu hạt, 2: Bột gà nêm chay, 3: Amila vàng nhỏ,4: Amila bạch kê cục,5: Bột nêm bào ngư,ĐV: Động vật (heo),TV: Thực vật (cải bắp),(-): Chứng âm,L: Thang chuẩn 100 bp Giếng TV xuất vạch sản phẩm chứng nội vị trí 426 bp, phù hợp với kết khảo sát in silico cặp mồi CLO1-CLO2 Giếng ĐV xuất vạchkích thước 154 bp với sản phẩm khuếch đại trình tự 16S rDNA cặp mồi TP1-TP2 Giếng 1, 3, xuất vạch sản phẩm chứng nội vị trí 426 bp, khơng xuất vạch vị trí 154 bpchứng tỏ mẫu âm tính (khơng nhiễm DNA động vật) Giếng không xuất vạch sản phẩm 154 bp, nhiên khơng thể kết luận mẫu âm tính thực khơng xuất vạch sản phẩm chứng nội 426 bp, chứng tỏ mẫu kiểm tra có thành phần phụ gia ức chế phản ứng PCR, mẫu cần phải có phân tích sau này, đặc biệt phải tìm hiểu thành phần phụ gia q trình chế biến có ảnh hưởng đến q trình khuếch đại hay khơng? Giếng xuất vạch mờ, Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 75 vạch vị trí 154 bp vạch vị trí 426 bp chứng tỏ mẫu dương tính (bị nhiễm DNA động vật) KẾT LUẬN Chúng tơi bước đầu thành công xây dựng sở khoa học để phát thành phần tạp nhiễm động vật thực phẩm chay dựa việc khuếch đại gen 16S rDNA ty thể động vật kết hợp với khuếch đại gen lục lạp sử dụng làm chứng nội cho phản ứng Đồng thời, tiến hành thử nghiệm thành công việc kiểm tra 23 mẫu thực phẩm chay thị trường, kết phát 9/23 (39,13%) mẫu nhiễm DNA động vật Từ kết khảo sát in silico đến in vitro cho thấy kit PCR chúng tơi hồn tồn đủ sở khoa học để kết luận bước đầu thành công xây dựng kit phát thành phần động vật thực phẩm chay, đồng thời tiến hành thử nghiệm lượng lớn mẫu thực phẩm chay TÀI LIỆU THAM KHẢO Anderson, J., Prior, S 2012.Vegetarian diets Food science and human nutrition, the Colorado State University Booton, G.C., Carmichael, J.R., Visvesvara, G.S., Byers, T.J., Fuerst, P.A.2003 ‘Identification of Balamuthia mandrillaris by PCR Assay Using the Mitochondrial 16S rRNA Gene as a Target’Journal of Clinical Microbiology41(1): pp.453-455 Chomczynski, P., Sacchi, N 2006 ‘The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on’Nature Protocols1(2): pp.581-585 Chomczynski, P., Sacchi, N 1987 ‘Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction’ Analytical Biochemistry 162: pp.156-159 Claude, C., Hermann, S., Eilber, U., Steindorf, K 2005 ‘Lifestyle determinants and mortality in German vegetarians and health-conscious persons: Results of a 21-year follow-up’Cancer Epideminol Biomarkers Prev14: pp 963-968 Girish, P.S., Anjaneyulu, A.S.R., Viswas, K.N., Anand, M., Rajkumar, N., Shivakumar, B.M., Bhaskar, S 2004 ‘Sequence analysis of mitochondrial 12S rRNA gene can identify meat species’Meat Science66: pp.551-556 Heulin, Surget-Groba, Y., Guiller, A., Guillaume, C.P., Deunff, J 1999 ‘Comparisons of mitochondrial DNA (mtDNA) sequences (16S rRNA gene) between oviparous and viviparous strains of Lacerta vivipara: a preliminary study’ Molecular Ecology8: pp.1627-1631 Hsieh, H.M., Tsai, C.C., Tsai, L.C., Chiang, H.L 2005 ‘Species identification of meat products using the cytochrome b gene’Forensic Science Journal4: pp.29-36 Ishizaki, S., Sakai, Y., Yano, T., Nakano, S., Yamada, T., Nagashima, Y., Shiomi, K., Nakao, Y., Akiyama, H 2012 ‘Specific detection by the polymerase chain reaction of potentially allergenic salmonid fish residues in processed foods’Biosci Biotechnol Biochem 76(5): pp.980-985 10 Karabudak, E., Kiziltan, G., Cigerim, N 2008 ‘A comparison of some of the cardiovascular risk factors in vegetarian and omnivorous Turkish females’J Hum Nutr Diet21: pp.13-22 11 Key, T.J., Appleby, P.N., Rosell, M.S 2006 ‘Health effects of vegetarian and vegan diets’Proc Nutr Soc65: pp.35-41 Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 76 12 Melton, T., Holland, C 2007 ‘Routine Forensic Use of the Mitochondrial 12S Ribosomal RNA Gene for Species Identification’J Forensic Sci62: pp.250-257 13 Michael, T.C., Brandon, S.G., Gerald, H.L., Jr, and Brian, R.M 1994 ‘Rates and patterns of chloroplast DNA evolution’Proceedings of the National Academy of Sciences USA 91: pp.6795-6801 14 Misener, S., Krawetz, S.A 1999 ‘Methods in Molecular Biology’, © Humana Press132: pp 365-386 15 Mitanin, T., Akane, A 2009 ‘Identification of animal species using the partial sequences in the mitochondrial 16S rRNA gene’Internationl Symposium Advances in legal Medicine11(1): pp.449-450  ... Mục đích nghiên cứu xây dựng kit PCR phát tạp nhiễm thành phần có nguồn gốc từ động vật áp dụng quy trình vào kiểm tra tính chay số mẫu thực phẩm chay thị trường VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu... 3, 4, 5: mẫu thực phẩm chay từ công ty Âu Lạc (thứ tự:đùi gà xả chay, thịt nạc kho chay, sườn ram chay, bò kho chay, pate gan ngỗng chay) 6, 7, 8: mẫu thực phẩm chay từ quán cơm chay Thủ Dầu... phẩm chay thị trường Khảo sát 23 mẫu thực phẩm chay thị trường (12 mẫu thực phẩm chay từ siêu thị, mẫu thu thập từ chợ Thủ Dầu Một tỉnh Bình Dương, mẫu cơng ty thực phẩm chay Âu Lạc, mẫu thực phẩm