Xử lý nước thải nuôi tôm bằng phương pháp sinh học đang được các nhà khoa học quan tâm. Nghiên cứu này được tiến hành nhằm sàng lọc các chủng Bacillus sp. chịu mặn và oxy hóa amoni để loại bỏ amoni trong nước thải nuôi tôm. Trong nghiên cứu này, đã sàng lọc được 08 chủng Bacillus sp. từ các vi khuẩn nội sinh phân lập từ cỏ Mần trầu.
Vietnam J Agri Sci 2022, Vol 20, No 3: 359-369 Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2022, 20(3): 359-369 www.vnua.edu.vn VI KHUẨN Bacillus sp NỘI SINH PHÂN LẬP TỪ CỎ MẦN TRẦU (Eleusine indica) CẢI THIỆN HIỆU QUẢ KHẢ NĂNG LOẠI BỎ AMONI TRONG NƯỚC NUÔI TÔM Đỗ Quang Trung1*, Trần Thị Tuyết Thu2, Lưu Thế Anh1 Viện Tài nguyên Môi trường, Đại học Quốc gia Hà Nội Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội * Tác giả liên hệ: trungcnsinh@gmail.com Ngày nhận bài: 03.08.2021 Ngày chấp nhận đăng: 21.01.2022 TĨM TẮT Xử lý nước thải ni tơm phương pháp sinh học nhà khoa học quan tâm Nghiên cứu tiến hành nhằm sàng lọc chủng Bacillus sp chịu mặn oxy hóa amoni để loại bỏ amoni nước thải nuôi tôm Trong nghiên cứu này, sàng lọc 08 chủng Bacillus sp từ vi khuẩn nội sinh phân lập từ cỏ Mần trầu Hai chủng lựa chọn MT50 MT51 có đặc tính như: hiệu suất loại bỏ amoni cao (lần lượt 80,36 82,24%), pH tối ưu sinh trưởng tốt mơi trường có nồng độ muối cao (4% NaCl) Ngồi ra, hai chủng cho thấy khả cải thiện nước thải ni tơm điều kiện phịng thí nghiệm Thí nghiệm TN1 với 1% huyền phù tế bào chủng MT51 cho thấy lượng amoni bị loại bỏ cao (62,38%), kết nghiệm thức khác khơng có ý nghĩa (P >0,05) Thí nghiệm TN2, chủng Bacillus sp loại bỏ amoni từ 72,25 78,85% ngày thứ Thí nghiệm TN3, chủng MT51 cho hiệu loại bỏ amoni cao với tỉ lệ bổ sung 1% huyền phù tế bào ngày thứ 79,91% Kết cho thấy hình thành nitrit nitrat thí nghiệm chất loại bỏ chủng Bacillus sp nghiên cứu Kết nghiên cứu cho thấy 02 chủng Bacillus sp phân lập lồi khử nitrat hiếu khí dị dưỡng Từ khóa: Loại bỏ amoni, nitrat hóa- phản nitrat hóa, vi khuẩn nội sinh, Bacillus sp chịu mặn Bacillus sp Isolated from Goose Grass (Eleusine indica) Enhances the Removal Efficiency of Ammonium in Shrimp Aquaculture ABSTRACT Treatment of aquaculture wastewater by biological method is being more attractive to the scientists This study aimed to screen the salt-tolerant and ammonia-oxidizing Bacillus endophytic bacteria having potential to reduce ammonium levels in shrimp aquaculture wastewater In this study, eight Bacillus strains were screened from endophytic bacteria isolated from gooose grass Among these strains, two strains, MT50 and MT51 showed the highest efficiency for ammonium removal (80.36 and 82.24%, respectively) They optimally grew at pH of and in highly salty condition (4% NaCl) Investigation in laboratory conditions for their ability in improving shrimp aquaculture th wastewater showed that both Bacillus strains had ammonium removal from 72.25 and 78.85% at day Notably, strain MT50 in combination with unsterilized shrimp-wastewater presented the highest ammonium removal efficiency th (79.91%) with 1% cell suspension at day The results also showed the nitrite and nitrate production in all experiments and these compounds were removed by the selected Bacillus species Results suggested that tưo Bacillus sp isolated might be used as heterotrophic nitrification-aerobic denitrification species Keywords: Ammonium removal, Endophytic bacteria, Nitrification-denitrification, Salt-tolerant Bacillus ĐẶT VẤN ĐỀ Amoni thành phỉn tă nhiên cûa chu trình nit h sinh thỏi sinh t mt lỵng ln thc ởn tha (Hmadhloo & cs., 2013) Hp chỗt cha nit thõi mụi trỵng cú th tọo cỏc vỗn nghiờm trng, chợng họn nhỵ hin tỵng phỳ dỵng cỏc khu vc sụng v ven bin (Hmadhloo & cs., 2013; Hong Phỵng H & cs., 2016; Nguyễn HĂu Đồng & cs., 2019; Quyen & 359 Vi khuẩn Bacillus sp nội sinh phân lập từ cỏ Mần trầu (Eleusine indica) cải thiện hiệu khả loại bỏ amoni nước nuôi tôm cs., 2020; Nguyen Thð Kim Anh & cs., 2021) Do đó, việc xā lý nỵc nuụi giõm s tớch tý nhanh chúng cỷa amoni nuôi trồng thûy sân ngày trć nên quan trọng Quá trình sinh học sā dýng vi khuèn nitrat hóa để biến đổi amoni thành nitrit tiếp týc chuyn nitrit thnh nitrat l mt cỏc phỵng phỏp ang ỵc quan tồm Trỵc ồy, vi khuốn nitrat húa ỵc bit n nhiu nhỵ Nitrobacter v Nitrosomonas (Zhang & cs., 2012; Ren & cs., 2019) Tuy nhiên, vi khuốn ny cú tc tởng trỵng chờm v cänh tranh hĄn so sánh vĆi vi khuốn d dỵng khỏc (Ren & cs., 2019) Mt nhng vi khuốn hn ỵc s dýng loọi b amoni hoc x lý nỵc thõi l Bacillus sp chỳng cú mt s ỵu vit nhỵ tởng trỵng nhanh, cänh tranh tốt, sā dýng nhiều cacbon nitĄ, chðu mðn hình thành nội bào tā (Manzo & cs., 2013; Meeboon & Saimmai, 2019; Ren & cs., 2019) Ngồi ra, đðc tính mong muốn để xā lý nỵc l v nuụi trng thỷy sõn bin l khõ nëng chðu mðn Vì vêy, việc phân lêp hiểu rõ đðc điểm cûa Bacillus trình nitrat húa v phõn nitrat húa l rỗt quan trng phỏt trin v ng dýng chỳng vo x lý nỵc thâi Vi khuèn nội sinh vi khuèn sống bên mô thăc vêt không gây bệnh cho vêt chû (Đỗ Quang Trung & cs., 2021) Chúng ngy cng ỵc quan tồm hn so vi cỏc vi khn khác phát triển nhiều lội cĄ chế khác để vơ hiệu hóa tác động cûa chỗt gõy ụ nhim chợng họn nhỵ s bin i cỏc chỗt ụ nhim thnh cỏc dọng ớt c hn lêp ion kim lội bề mðt tế bào (Ijaz & cs., 2015) Gæn đåy, nhiều vi khuốn ni sinh (VKNS) ó ỵc phõn lờp t cỏc loi thc vờt khỏc v ỵc s dýng tởng hiu quõ phõn hỷy cỏc chỗt ụ nhim nỵc thõi (Shahid & cs., 2020; Ijaz & cs., 2015) Ijaz & cs (2015) sā dýng dòng vi khuèn nội sinh (Acinetobacter sp., Bacillus cereus Bacillus licheniformis) loọi b hn 75% hm lỵng amoni nỵc thõi ngy Do cỏc hoọt ng phõn hỷy chỗt ụ nhim v thỳc ốy tởng trỵng thc vờt, vi khuốn ni sinh rỗt cú trin vng i vi mt s phỵng phỏp x lý nỵc thõi (Khan & cs., 2013; Shahid & cs., 2020) 360 Cỏ Mæn træu (Eleusine indica) loäi cỏ phổ biến ć Việt Nam Chúng ỵc coi l loi thc vờt siờu tớch tý vỡ xā lý số kim lội nðng (Tampubolon & cs., 2020) Ngoi ra, c Mổn trổu ỵc bỏo cỏo cú th chu ỵc mn khỏ cao (55 dS/m cûa NaCl) (Wiecko, 2003) Các chûng vi khuèn ni sinh ỵc phõn lờp t c Mổn trổu ó ỵc chng minh cú tim nởng kim soỏt sinh học bệnh thăc vêt (Đỗ Quang Trung & cs., 2021) Do đó, mýc đích cûa nghiên cĀu sàng lc cỏc chỷng vi khuốn ni sinh ỵc phõn lờp tÿ cỏ Mỉn trỉu có khâ nëng chuyển hóa amoni, têp trung phân lêp chûng vi khuèn Bacillus sp chðu mðn xác đðnh hiệu quâ loäi b amoni nỵc thõi nuụi tụm PHNG PHP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Tổng số 16 chûng vi khuốn ni sinh ỵc phõn lờp t c Mổn trổu thu thêp tÿ tỵnh Bình Thn, số chûng phân lêp ỵc t thõn, lỏ v r lổn lỵt l 5; (Đỗ Quang Trung & cs., 2021) Các chỷng ny ỵc lỵu tr tọi Phũng thớ nghim cỷa Vin Ti nguyờn v Mụi trỵng, 19 Lờ Thỏnh Tụng, Hon Kim, H Ni 2.2 Húa cht Tỗt cõ cỏc húa chỗt ỵc s dýng cho nghiờn cu ny bao gm MgCl2; NaCl; K2PO4; CaCO3; FeCl3; Na2COONa; NaHCO3 ỵc cung cỗp bi cụng ty Merck - CHLB c v thọch cú nhit núng chõy thỗp ỵc mua t hóng Biobasic, Canada Tỗt cõ húa chỗt cú tinh khit tÿ 99,0-99,9% sā dýng cho phép phân tích phịng thí nghiệm 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Sàng lọc vi khuẩn Bacillus Các chûng vi khuèn nội sinh thc vờt ỵc nuụi 10ml canh trỵng dinh dỵng cú b sung 2% NaCl v mụi trỵng tởng sinh (peptone 5g, dðch chiết thðt bò 3g, muối biển 2g, thc ởn cho tụm 1g v H2O 1.000ml) Canh trỵng ỵc nuụi lớc 30C, 170 vũng/phỳt 24 gi Một Đỗ Quang Trung, Trần Thị Tuyết Thu, Lưu Thế Anh mililit dch khuốn ỵc pha loóng ng cha 9ml nỵc cỗt Cỏc ng ny ỵc x lý nồi cách thûy 80°C 10 phút để loäi bỏ t bo sinh dỵng v cỏc chỷng vi sinh khụng sinh bo t (Marquis & Bender, 1985) Sau ú, lỗy 0,1ml dch pha loóng trõi trờn thọch dinh dỵng ỵc bổ sung 2% NaCl (Zhao & cs., 2017) Vi khuèn cú c im nhỵ Gram dỵng, hỡnh que v hỡnh thnh ni bo t ỵc chn lc v chuyn sang mụi trỵng mi Cỏc chỷng vi khuốn Bacillus sp tinh khit thu ỵc bỡng cỏch lp lọi nhiu lổn trờn đïa thäch mĆi Chûng vi khuèn có mĀc độ oxy húa amoni cao ó ỵc la chn giõi trỡnh tă đoän gen 16S rRNA: tách chiết gen vi khuèn bìng kit cûa QIAgen, khuếch đäi trình tă bìng phân Āng PCR vĆi cðp mồi có trình tă nhỵ sau 27F (5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3) v 1492R (5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3) Phõn ng PCR ỵc thc hin 50àl master mix bao gm: 25àl 2X Taq Master Mix (Biobasic Canada); loäi mồi nồng 10àm: 1,5àl; 11àl nỵc cỗt (dH2O) v 1àl DNA tÿ vi khuèn Phân Āng PCR gồm 35 chu kì bao gồm giai độn tiền biến tính: 95°C phút; giai độn biến tính 95°C 30 giây; giai độn bít cðp cûa mồi: 58°C phút; giai đoän kéo dài đoän khuếch đäi: 72°C phút giai đoän kéo dài cuối: 72°C 10 phỳt Cỏc sõn phốm PCR ỵc in di trờn gel agarose 1% dung dðch TBE 1X Sā dýng 10µl sân phèm cho vào tÿng giếng Chäy điện di vĆi hiệu điện 100V 25 phút Kết quâ in di ỵc quan sỏt bỡng mỏy chýp õnh gel (Bio-Rad, Hoa Kì) Độn khuếch đäi PCR cûa độn gen 16S rRNA cỷa tng mộu vi khuốn ỵc gi giõi trình tă täi hãng First Base (The Gemini, Singapore Science Park II, Singapore) Cỏc trỡnh t nucleotide hon chợnh ỵc so sánh vĆi ngân hàng dĂ liệu GenBank cûa NCBI bìng cách sā dýng cơng cý BLAST 2.3.2 Đánh giá khả oxy hóa amoni chủng Bacillus sp phân lập Một ml chûng vi khuèn Bacillus sp (mờt t bo khoõng 107 CFU/ml) ỵc chuyn vo mụi trỵng dinh dỵng NB (peptone 5g, dch chit tht bò 3g, amoni sulfat 15g H2O 1.000ml) û 30C ngy Hm lỵng amoni ỵc xỏc đðnh bìng kit Ammonium Test (ID 110024, Merk) Sā dýng theo hỵng dộn kốm theo cỷa b kit 2.3.3 Th nghiệm đặc tính khử nitrat hóa dị dưỡng Các chûng Bacillus sp (mờt t bo khoõng 107 CFU/ml) ỵc ỷ bỡnh tam giỏc 250ml cha 100ml mụi trỵng nitrat húa d dỵng ((NH4)2SO4: 0,66g, natri succinat: 4,72g, KH2PO4: 0,50g, Na2HPO4: 0,50g, MgSO4∙7H2O: 0,20g, NaCl: 20g H2O 1.000ml) (Zhang & cs., 2012) Quỏ trỡnh ỷ ỵc thc hin ć 30°C máy líc quay ć tốc độ 160 vòng/phút ngày Nồng độ cûa nitĄ amoni (NH4+-N), nitrit (NO2 N) v nitrat (NO3 N) ỵc xỏc nh vào ngày thĀ (Lu & cs., 2012; Nguyễn HĂu ng & cs., 2019) Hm lỵng nitrate/nitrite ỵc xỏc nh bỡng kit NITRITE/NITRATE, colorimetric method (Merk); Hm lỵng amoni ỵc xác đðnh bìng kit Ammonium Test (ID 110024, Merk) Sā dýng theo hỵng dộn kốm theo cỷa b kit 2.3.4 Đánh giá nhu cầu muối pH tối ưu cho phát triển chủng vi khuẩn thu Mt mililit huyn phự t bo ỵc nuụi cỗy mt ng cú 10ml mụi trỵng dinh dỵng NB pH cỷa mụi trỵng NB iu chợnh cỏc giỏ trð 3, 5, 7, 11 Thā nghiệm ânh hỵng cỷa nng mui ỵc tin hnh cỏc nng nhỵ sau 0, 1%, 2%, 3% v 4% Cỏc ng nuụi cỗy ỵc lớc vi tc 170 vũng/phỳt 24 gi Tc sinh trỵng cỷa Bacillus sp ỵc xỏc nh bỡng mờt quang hc (OD) ć 600nm (Seenivasagan & cs., 2017) 2.3.5 Chuẩn bị nước thi nuụi tụm Bn thớ nghim v cỏc loọi nỵc thõi tụm khỏc ó ỵc thit k ỏnh giỏ õnh hỵng cỷa cỏc vi sinh vờt cú sùn nỵc thõi, nỵc thõi thớ nghim ỵc chia thnh xā lý tiệt trùng không tiệt trùng Trong loọi loọi ny, ỵc phõn chia tip thnh lờn men 361 Vi khuẩn Bacillus sp nội sinh phân lập từ cỏ Mần trầu (Eleusine indica) cải thiện hiệu khả loại bỏ amoni nước nuôi tôm không lờn men ỏnh giỏ õnh hỵng cỷa cỏc chỗt dinh dỵng thc ởn n hoọt tớnh cỷa cỏc chûng nghiên cĀu Đối vĆi thā nghiệm lên men, nỵc thõi nuụi tụm ỵc tng hp bỡng cỏch lờn men 1% thc ởn thỵng phốm cho tụm ngy Tng hp cỏc mộu nỵc thõi nuụi tụm dựng thớ nghim ỵc th hin bõng 2.3.6 Đánh giá hiệu loại bỏ amoni Các chûng Bacillus sp cú hiu quõ kh amoni cao ỵc nghiờn cu khâ nëng lội bỏ nitĄ vơ cĄ bốn lội nỵc thõi cỷa tụm ó chuốn b (Bõng 1) Huyn phự t bo cỷa cỏc vi khuốn Bacillus sp ỵc nuụi qua ờm mụi trỵng NB lng (mờt tế bào khoâng 107 CFU/ml) Trong nghiên cĀu thā nghim, huyn phự t bo vi khuốn ỵc s dýng cõ 1% (50ml) v 5% (250ml) 5l nỵc thõi ó chuốn b Thớ nghim C ỵc chuốn b ging nhỵ cỏc thớ nghim khỏc nhỵng khụng cú thờm canh trỵng vi khuốn Tỗt cõ cỏc thớ nghim v i chng (C) ỵc thc hin ngy Mộu nỵc thõi ỵc lỗy mộu v kim tra nng amoni, nitrit v nitrat theo phỵng phỏp o mu tiờu chuốn vào ngày thĀ ngày thĀ sau cỗy vi khuốn (Nguyn Hu ng & cs., 2019) 2.3.7 Phõn tớch thng kờ Cỏc s liu thớ nghim ỵc ỏnh giỏ bỡng cỏc phỵng phỏp thng kờ phõn tớch bin lỵng ANOVA (Analysis of Variance) mt nhõn t, so sánh giá trð trung bình theo chuèn Ducan Các s liu ghi nhờn ỵc x lớ bỡng Excel v phæn mềm Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) phiên bân 19 Bâng Xử lý nước thâi từ nuôi tơm để nghiên cứu loại bỏ amoni Thí nghiệm Nước thải không trộn 1% thức ăn tôm Nước thải trộn 1% thức ăn tôm TN Khử trùng (121°C, 15 phút) Lên men (trong ngày) TN Khử trùng (121°C, 15 phút) Không lên men TN Không khử trùng Lên men (trong ngày) TN Không khử trùng Không lên men Ghi chú: Giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (thanh sai số) cho ba lần lặp lại Dấu cho thấy khác biệt có ý nghĩa (P