Phân lập và xác định một số gene sinh độc tố của vi khuẩn Clostridium perfringens trên gà

Đề tài nghiên cứu được thực hiện với mục đích xác định tỉ lệ hiện diện C. perfringens và phát hiện một số gene quy định khả năng sinh độc tố của C. perfringens phân lập từ gà thả vườn. Tổng số 238 mẫu ruột gà được lấy từ 23 trại (20 trại gà có biểu hiện lâm sàng trên đường tiêu hóa, 3 trại gà khỏe) tại một số tỉnh phía Nam được sử dụng để xác định sự hiện diện và một số gene quy định khả năng sinh độc tố của C. perfringens bằng phương pháp nuôi cấy phân lập và kỹ thuật PCR.

Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Kỷ yếu khoa học PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ GENE SINH ĐỘC TỐ CỦA VI KHUẨN CLOSTRIDIUM PERFRINGENS TRÊN GÀ Lê Đào Diễm Kha* Trường Đại học Nơng lâm thành phố Hồ Chí Minh *Tác giả liên hệ: ledaodiemkha@gmail.com TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu thực với mục đích xác định tỉ lệ diện C perfringens phát số gene quy định khả sinh độc tố C perfringens phân lập từ gà thả vườn Tổng số 238 mẫu ruột gà lấy từ 23 trại (20 trại gà có biểu lâm sàng đường tiêu hóa, trại gà khỏe) số tỉnh phía Nam sử dụng để xác định diện số gene quy định khả sinh độc tố C perfringens phương pháp nuôi cấy phân lập kỹ thuật PCR.Trên mẫu lấy từ gà bệnh, tỉ lệ diện Clostridium spp C perfringens 51,5 % 16,8 % Trên mẫu lấy từ gà khỏe, tỉ lệ diện Clostridium spp C perfringens 27,8 % 18,2 % phân lập C perfringens mang gene cpa, 4,5 % mang gene cpb gene netB không phát tất phân lập Từ khóa: C.perfringens, gene sinh độc tố, PCR ISOLATED AND DETERMINE TOXIN GENE OF CLOSTRIDIUM PERFRINGENS FROM CHICKEN Le Dao Diem Kha* Nong Lam University, NLU-HCM *Corresponding authour: ledaodiemkha@gmail.com ABSTRACT The study was conducted to determine the incidence of C perfringens and to detect some of the genes that regulate the ability to produce toxins of C perfringens isolated from the chickens A total of 238 chicken intestinal specimens were collected from 23 farms (20 chicken farms with digestive tract and healthy chicken farms) in some southern provinces used to determine the presence and some genes toxicity of C perfringens by culture and PCR technique On the samples taken from diseased chickens, the presence rate of Clostridium spp and C perfringens were 51.5% and 16.8% On samples from healthy chickens, the presence rate of Clostridium spp and C perfringens was 27.8% 18.2% C perfringens isolates carry the cpa gene, 4.5% carry the cpb gene and the netB gene is not detectable on all isolates Keywords: C perfringens, toxin gene, PCR TỔNG QUAN Clostridium perfringens (C perfringens) vi khuẩn gram dương, có khả sinh bào tử (Hình 1), phát triển tốt mơi trường kị khí có khả sống điều kiện hiếu khí C perfringens khu trú đường ruột động vật người không gây bệnh Khi gặp điều kiện thuận lợi vi khuẩn tăng nhanh số lượng sinh độc tố Tùy tác động loại độc tố gây thể bệnh với biểu lâm sàng bệnh tích khác gà (Park ctv, 2015) C perfringens phân thành type bao gồm A, B, C, D E dựa vào khả sinh loại độc tố alpha (α), beta (β), epsilon (ε) iota (ι) C perfringens type A nguyên nhân gây bệnh viêm ruột hoại tử gà thường phân lập từ trường hợp lâm sàng thú y C perfringens type C tác nhân gây viêm ruột hoại tử gia cầm người không phổ biến type A C perfringens type B, D E gây bệnh chủ yếu lồi dê, cừu, bị heo (Jalbert, 2008; Llanco ctv, 2012) 448 Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Kỷ yếu khoa học Hình Vi khuẩn C perfringens VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP định danh vi khuẩn C perfringens Nội dung 1: Xác định Clostridium spp Bảng Số lượng mẫu khảo sát Đối tượng lấy mẫu Số trại (n) Số mẫu gà (n) Gà khỏe 36 Gà bệnh 20 202 Tổng cộng 23 238 Cách lấy mẫu bảo quản mẫu Nội dung 2: Xác định số gene quy Lấy mẫu trại: Gà lấy theo nhóm: định khả sinh độc tố vi khuẩn C (1) Gà khỏe (gà không biểu triệu chứng perfringens bệnh), (2) gà bệnh (kém ăn, chậm lớn, gầy Ly trích DNA vi khuẩn C perfringens ốm, xù lông tiêu chảy phân sáp có Lấy vịng canh khuẩn từ ống vi khuẩn lẫn máu) Gà mang phòng xét (gốc vi khuẩn C perfringens bảo quản nghiệm, tiến hành mổ khám để quan sát bệnh -70oC) cấy mơi trường thạch máu tích lấy chất chứa bên ruột làm mẫu (nuôi cấy điều kiện yếm khí, 37oC 24 phân lập C perfringens 28 giờ) Xử lý mẫu ruột để phân lập vi khuẩn: dùng Dùng que cấy vô trùng chọn khuẩn lạc kéo vơ trùng cắt dọc ruột để bộc lộ lịng ruột, đặc trưng (tròn, trắng xám, bề mặt phẳng) để sau cạo lấy hết chất chứa có bên ni cấy mơi trường BHI (yếm khí, ruột sử dụng làm mẫu nuôi cấy Lấy gram 37oC/24 giờ) chất chứa pha với ml dung dịch nước muối Quy trình ly trích: theo quy trình kít ly sinh lý (NaCl 0,9%), đồng hỗn hợp chất trích DNeasy mericon Food Kit Cat No chứa vortex, sau ủ mẫu 70oC/15 69514 (Qiagen) phút Chọn mồi (primer) Quy trình phân lập Clostridium spp định Các đoạn mồi dùng phản ứng để xác danh C perfringens theo TCVN 8400: 28, định gene độc tố cpa, cpb netB (Bảng 2014 phịng thí nghiệm vi sinh ISARA 2) Bảng Trình tự mồi sử dụng phản ứng PCR xác định gene độc tố Độc Kích thước Gene Trình tự mồi (5’ - 3’) TLTK tố (bp) F (GTTGATAGCGCAGGACATGTTAAG) Osman cpa Alpha 402 R (ATGTAGTCATCTGTTCCAGCATC) ctv, 2012 F (ACTATACAGACAGATCATTCAACC) Osman cpb Beta 236 R (TTAGGAGCAGTTAGAACTACAGAC) ctv, 2012 F (GCTGGTGCTGGAATAAATGC) Tolooe netB NetB 384 R (TCGCCATTGAGTAGTTTCCC) ctv, 2011 449 Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Kỷ yếu khoa học chứng âm cho phản ứng PCR Thực phản ứng PCR Các thành phần cho phản ứng PCR bao gồm 12,5 µl GoTaq G2 Green Master Mix 2X, KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN µl mồi loại, µl DNA template thêm Tỷ lệ diện Clostridium spp nước vừa đủ 25 µl Kết phân lập Clostridium spp cho thấy Chu trình nhiệt phát gene cpa: giai đoạn 47,9 % mẫu khảo sát có diện tiền biến tính 95oC/2 phút cuối Clostridium spp Tỉ lệ Clostridium spp phản ứng trì 72oC/5 phút Phản ứng mẫu ruột tương tự nghiên cứu khuếch đại lặp lại 40 chu kỳ với bước Mirhosseini (2010) với 65,6% 59,4% mẫu biến tính 95oC/60 giây, bắt cặp mồi vào phân lập từ gà 14 30 ngày tuổi có khn 57oC/60 giây, kéo dài 72oC/60 diện Clostridium spp Sự diện giây Gene cpb: giai đoạn tiền biến tính gà khỏe gà bệnh cho thấy Clostridium 95oC/5 phút cuối phản ứng spp vi khuẩn thuộc hệ vi sinh vật khu trú trì 72oC/3 phút Phản ứng khuếch đại lặp lại thường xuyên ruột gà 35 chu kỳ với bước biến tính 94oC/60 Kết phân lập Clostridium spp giây, bắt cặp mồi vào khuôn 55oC/60 giây, nghiên cứu cho thấy tỉ lệ kéo dài 72oC/60 giây Gene netB: giai đoạn diện Clostridium spp gà bệnh (51,5%) tiền biến tính 94oC/2 phút cuối cao gà khỏe (27,8%) (P < 0,01) Việc phản ứng trì 72oC/12 phút Phản tăng tỉ lệ phát Clostridium spp cho thấy ứng khuếch đại lặp lại 35 chu kỳ với gà bệnh, hệ vi sinh vật đường ruột có bước biến tính 94oC/30 giây, bắt cặp mồi vào cân dẫn đến làm tăng số lượng khuôn 55oC/30 giây, kéo dài 72oC/60 vi khuẩn đường ruột có hại có giây Clostridium spp Kết phân lập Điện di gel agarose đọc kết Clostridium spp nghiên cứu chúng Sản phẩm phản ứng PCR phát cho thấy tỉ lệ diện Clostridium spp kỹ thuật điện di gel agarose nồng gà bệnh (51,5%) cao gà khỏe độ 1,5% dung dịch đệm TBE 0,5X (27,8%) (P < 0,01) Việc tăng tỉ lệ phát đọc kết máy chuyên dụng (Biorad Clostridium spp cho thấy gà bệnh, hệ vi UV 2000) Sử dụng thang chuẩn DNA sinh vật đường ruột có cân (ladder) 100 bp để ước lượng kích thước dẫn đến làm tăng số lượng vi khuẩn đường đoạn sản phẩm PCR C perfringens ATCC ruột có hại có Clostridium spp 13.124 dùng làm đối chứng dương, Tỷ lệ diện C perfringens Staphylococcus aureus ATCC 29213 làm đối Bảng Tỷ lệ diện C perfringens gà khỏe gà bệnh Mẫu khảo sát Đối tượng Số lượng Số mẫu (+) Tỷ lệ Gà bệnh 202 34 16,8 %a P > 0,05 Gà khỏe 36 10 27,8 %a Trong nghiên cứu này, tỷ lệ phát C chúng tơi bị ảnh hưởng việc perfringens mẫu ruột gà khỏe (27,8%) cao điều trị kháng sinh nước uống tỉ lệ nhiễm C perfringens mẫu ruột gà trại gà bệnh, kháng sinh làm bệnh (16,8%), nhiên khác biệt không giảm phát triển vi khuẩn đường ruột nên tỉ có ý nghĩa mặt thống kê (P > 0,05), lệ phát gà bệnh thấp so với gà số lượng mẫu khảo sát gà khỏe gà khỏe tỉ lệ thống kê không cho thấy bệnh chênh lệch q lớn Thơng thường khác biệt có ý nghĩa tỉ lệ diện C perfringens mức độ cao C perfringens diện mức 16,8% thấp thuộc nhóm gà có triệu chứng lâm sàng nghiên cứu số nước đường tiêu hóa Nhiều nghiên cứu gần Iran 43,7% (Ezatkhah ctv, 2016), cho thấy gà khỏe khơng có diện Jordan 43,2% (Gharaibeh ctv, 2010) Sự C perfringens (Llanco ctv, 2012), hay tỉ lệ chênh lệch tỉ lệ phân lập C.perfringens diện C perfringens mức thấp 9,9% gà chúng tơi khảo sát (Yan ctv 2016) Kết phân lập trại có quy mơ nhỏ (1.000 – 3.000 con) nuôi 450 Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 giống gà thả vườn, nghiên cứu nước thực trang trại chăn nuôi công nghiệp với số lượng lớn (> 10.000 con) Theo khảo sát chúng tơi, 100 % trại có sử dụng kháng sinh thức ăn nước uống với mục đích tăng trọng phòng bệnh ức chế phát triển hệ vi sinh đường ruột có C perfringens điều gây giảm tỉ lệ phát phương pháp nuôi cấy phân lập Kết xác định gene quy định yếu tố độc lực C perfringens phân lập Kết cho thấy 18,2% phân lập C perfringens mang gene cpa, 4,5% phân lập C perfringens mang gene cpb khơng có gốc C perfringens mang gene netB Tỉ lệ diện gene cpa theo số nghiên cứu lên đến 100% chủng vi khuẩn C perfringens gây bệnh viêm ruột hoại tử thể lâm sàng (Llanco ctv, 2012; Svobodová ctv, 2007; Yan ctv, 2016) Trong nghiên cứu chúng tôi, chủng C perfringens khảo sát phân lập từ gà có biểu lâm sàng đường tiêu hóa mà khơng có dấu hiệu điển hình viêm ruột hoại tử C perfringens Kỷ yếu khoa học gà khỏe, tỉ lệ C perfringens mang gene sinh độc tố diện mức thấp Khác với gene cpa cho diện thường xuyên chủng vi khuẩn C perfringens, gene cpb (sinh độc tố beta) diện không thường xuyên mức thấp Trong số nghiên cứu gần cho thấy gene cpb chí khơng diện chủng C perfringens phân lập gà (Gharaibeh ctv, 2010; Ezatkhah ctv, 2016) Kết khảo sát cho thấy C perfringens mang gene cpb chiếm tỉ lệ 4,5 % (2/44) tổng số gốc C perfringens phân lập gà bệnh đồng thời mang gene cpa Nghiên cứu không phát gene netB từ chủng C perfringens phân lập gà khỏe gà bệnh Kết phù hợp với nghiên cứu Yan ctv (2016) báo cáo gene netB diện chủng C perfringens phân lập từ gà có triệu chứng điển hình (thể lâm sàng) bệnh viêm ruột hoại tử không phát chủng C perfringens phân lập từ gà khỏe Hình Kết PCR với gene sinh độc tố alpha (gene cpa) Hình Kết PCR với gene sinh độc tố beta (gene cpb) Kết định type vi khuẩn C.perfringens sinh độc tố theo phân loại Petit ctv (1999) type chủ yếu dựa kiểu gene sinh độc tố Dựa vào kết diện gene quy định khả lưu hành gây bệnh gà (Trích dẫn 451 Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Brady ctv, 2010) khảo sát cho thấy có 13,6% phân lập C perfringens thuộc type A 4,5% phân lập C perfringens thuộc type C Các phân lập C perfringens lại chưa xác định type khảo sát khảo sát gene quy định khả sinh độc tố alpha (gene cpa), beta (gene cpb) NetB (gene netB), khơng thể xác định đầy đủ type khác Tỉ lệ diện gene sinh độc tố alpha (gene cpa) (18,2%) cao so với gene cpb (4,5%) bước đầu cho thấy type A type phổ biến trại gà quy mô nhỏ khuôn khổ nghiên cứu KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Tỷ lệ Clostridium spp diện gà bệnh (51,4%) cao gà khỏe (27,8%) (P < 0,01) C perfringens diện đồng thời gà bệnh gà khỏe (thống kê chưa cho thấy Kỷ yếu khoa học khác biệt P > 0,05) Tần số phất gene cpa cpb mức 18,2% 4,5% chủng C perfringens phân lập 13,6% phân lập C perfringens thuộc type A 4,5% phân lập C perfringens thuộc type C Đề nghị Khảo sát số mẫu tương đương gà khỏe gà bệnh nhằm đáng giá xác tỉ lệ diện C perfringens nhóm đối tượng Khảo sát diện gene quy định khả sinh số độc tố quan trọng khác epsilon, iota, theta… để có sở phân loại với gốc C perfringens chưa xác định type Thực nghiên cứu trại gà quy mô công nghiệp để đánh giá toàn diện mức độ nhiễm phân type C perfringens TÀI LIỆU THAM KHẢO EZATKHAH, M., ALIMOLAEI, M., SHAHDADNEJAD, N., 2016 The Prevalence of netB Gene in Isolated Clostridium perfringens From Organic Broiler Farms Suspected to Necrotic Enteritis Int J Enteric Pathog (3): 035 - 037 FREEDMAN, J.C., SHRESTHA, A and MCCLANE, B.A., 2016 Clostridium perfringens Enterotoxin: Action, Genetics, and Translational Application Toxin (73): - 16 JOHANSSON, A., GREKOB, C., ENGSTROMC, B.E., KARLSSONB, M., 2004 Antimicrobial susceptibility of Swedish, Norwegian and Danish isolates of Clostridium perfringens from poultry, and distribution of tetracycline resistance genes Veterinary Microbiology 99: 251 - 257 KEYBURN, A.L., BANNAM, T.L., MOORE, R.J and ROOD, J.I., 2008 NetB, a Pore - Forming Toxin from Necrotic Enteritis Strains of Clostridium perfringens PloSPathog (2): - 11 LLANCO, L.A., NAKANO, V., FERREIRA, A.J.P and AVILA – CAMPOS, M.J., 2012 Toxinotyping and Antimicrobial Susceptibility of Clostridium perfringens Isolated From Broiler Chickens with Necrotic Enteritis International Journal of Microbiology Research (7): 290 294 FAN, Y C., WANG, C.L., WANG, C., CHEN, T.C., CHOU, C.H and TSAI, H.J., 2016 Incidence and Antimicrobial Susceptibility to Clostridium perfringens in Premarket Broilers in Taiwan Avian dieases 60: 444 - 449 452 ... cấy phân lập Kết xác định gene quy định yếu tố độc lực C perfringens phân lập Kết cho thấy 18,2% phân lập C perfringens mang gene cpa, 4,5% phân lập C perfringens mang gene cpb khơng có gốc C perfringens. .. bệnh vi? ?m ruột hoại tử không phát chủng C perfringens phân lập từ gà khỏe Hình Kết PCR với gene sinh độc tố alpha (gene cpa) Hình Kết PCR với gene sinh độc tố beta (gene cpb) Kết định type vi khuẩn. .. 13,6% phân lập C perfringens thuộc type A 4,5% phân lập C perfringens thuộc type C Các phân lập C perfringens lại chưa xác định type khảo sát khảo sát gene quy định khả sinh độc tố alpha (gene