Việc loại bỏ tế bào T của người hiến tặng ra khỏi mô ghép trước khi đưa vào cơ thể người nhận có ý nghĩa vô cùng quan trọng, quyết định sự thành công của một ca cấy ghép tủy xương đồng loài. Trong nghiên cứu này, tác giả tiến hành tạo hạt từ miễn dịch phòng thí nghiệm nhằm phân tách tế bào Jurkat T ra khỏi dịch nuôi tế bào. Kháng thể kháng tế bào Jurkat T được gắn định hướng lên bề mặt hạt từ thông qua protein A/G, một protein bắt đặc hiệu vùng Fc của kháng thể.
Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Kỷ yếu khoa học TẠO VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG LOẠI BỎ TẾ BÀO JURKAT CỦA HẠT TỪ MIỄN DỊCH ANTI-PAN T Trần Nguyễn Thảo Sương* Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh *Tác giả liên hệ: suongleo95@gmail.com TÓM TẮT Việc loại bỏ tế bào T người hiến tặng khỏi mô ghép trước đưa vào thể người nhận có ý nghĩa vơ quan trọng, định thành công ca cấy ghép tủy xương đồng loài Trong nghiên cứu này, tác giả tiến hành tạo hạt từ miễn dịch phòng thí nghiệm nhằm phân tách tế bào Jurkat T khỏi dịch nuôi tế bào Kháng thể kháng tế bào Jurkat T gắn định hướng lên bề mặt hạt từ thông qua protein A/G, protein bắt đặc hiệu vùng Fc kháng thể Việc gắn protein A/G lên bề mặt hạt từ hình thành nhờ liên kết cộng hóa trị gốc amin bề mặt hạt từ protein thông qua chất xúc tác 3-(2 Pyridyldithio) propionic acid N-hydroxysuccinimide ester (SPDP) Hạt từ phòng thí nghiệm có khả gắn kết khoảng 85µg protein A/G 21µg kháng thể mg hạt từ Hiệu phân tách tế bào Jurkat T hạt từ miễn dịch khoảng 53,3% Từ khóa: Ghép tủy đồng loài, GvHD, hạt từ miễn dịch, MACS CREATION AND ASSESSMENT OF JURKAT T REMOVAL ABILITY OF IMMUNOMAGNETIC NANOPARTICLES Tran Nguyen Thao Suong* University of Science – VNU Ho Chi Minh City *Corresponding Author: suongleo95@gmail.com ABSTRACT Removal of the donor T-cells is unmet need In this study, we prepared immunomagnetic nanoparticles for separation of Jurkat T cells from cell culture Anti-Jurkat T antibodies were conjugated onto magnetic nanoparticles via recombinant protein A/G, an antibody’s Fcspecific binding protein The bonds between protein A/G and immunomagnetic nanoparticles are covalently linked by amine groups on the surface of magnetic nanoparticles and the protein through 3-(2 Pyridyldithio) propionic acid N-hydroxysuccinimide ester (SPDP) Approximately 85μg of protein A/G and 21μg of antibody were bound to one mg of magnetic beads The immunomagnetic nanoparticles was capable to isolate up to 53,3% of Jurkat T cells from culture medium Keywords: Allogeneic hematopoietic stem cell transplant, GvHD, immunomagnetic nanoparticles, MACS TỔNG QUAN Cấy ghép tủy xương hay gọi cấy ghép tế bào gốc tạo máu phương pháp thay tế bào gốc máu bị hư hỏng tế bào gốc máu khỏe mạnh Đây phương pháp trị liệu ứng dụng phổ biến điều trị ung thư nay, đặc biệt điều trị ung thư máu Phương pháp mang lại nhiều lợi ích so với phương pháp điều trị truyền thống hóa trị xạ trị người bệnh hạn chế nguy nhiễm trùng, suy giảm miễn dịch hay tử vong Khi định điều trị phương pháp cấy ghép tủy xương, người bệnh xem xét chọn lựa việc cấy ghép tự thân hay cấy ghép đồng loài Cấy ghép đồng loài phương án dần quan tâm chúng giải nhược điểm cấy ghép tự thân, đồng thời giai đoạn khan mô ghép cấy ghép đồng lồi phương pháp hứa hẹn mang lại nhiều hy vọng Tuy nhiên nhược điểm lớn cấy ghép đồng lồi biến chứng vật ghép chống chủ (Graft VersusHost-Disease – GvHD), nguyên nhân biến chứng tế bào miễn dịch lympho B, lympho T, đại thực bào, tế 106 Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 bào giết tự nhiên nhân tố kích thích yếu tố hoại tử khối u (TNF), interleukin (IL-1)… mô tủy ghép người cho nhận diện tế bào người nhận kháng nguyên lạ, dẫn đến công, làm thương tổn tế bào mô người nhận Nhiều nghiên cứu diện tế bào lympho T người hiến tặng mơ ghép ngun nhân gây đáp ứng miễn dịch không mong muốn triệu chứng có hại cho người nhận mơ ghép Bệnh nhân gặp phải biến chứng vật ghép chống chủ thường biểu triệu chứng vàng da, nôn mửa, tiêu chảy,… nghiêm trọng dẫn tới xơ gan, xơ cứng da và chí tử vong Tuy nhiên, có nhiều nghiên cứu chứng minh, diện ngưỡng định tế bào lympho T mơ tủy ghép có khả gia tăng hội đậu ghép cho bệnh nhân hỗ trợ di cư tế bào gốc tạo máu vị trí mong muốn có khả tiêu diệt tế bào ung thư sót lại thể tế bào lympho T Do vậy, để khắc phục GvHD việc loại bỏ phần tế bào lympho T điều cần thiết Hiện có nhiều kỹ thuật phân tách tế bào ứng dụng rộng rãi lĩnh vực y-sinh phân tách tế bào cách nuôi cấy, phân tách ly tâm, cột sắc ký lực, đánh dấu huỳnh quang, đánh dấu từ tính… Tùy thuộc vào mục đích người nghiên cứu, kỹ thuật phân tách tế bào phù hợp lựa chọn Đối với mô ghép tế bào gốc máu, yêu cầu độ tinh đặc hiệu cao phương pháp phân tách tế từ tính (MACS) phương pháp thích hợp, ứng dụng lâm sàng cấy ghép với nhiều ưu điểm bật tương thích sinh học, độ tinh hiệu suất thu hồi cao, thao tác đơn giản khơng q tốn (Hình 1) Hình Kỹ thuật phân tách tế bào dựa vào từ tính (Magnet-activated cell sorting MACS) Kỷ yếu khoa học Kỹ thuật MACS dựa đánh dấu tế bào mục tiêu kháng thể gắn với hạt nano có từ tính Dịch huyền phù tế bào sau đánh dấu đặt từ trường mạnh, tế bào đánh dấu từ trường di chuyển theo hướng có lượng từ trường, từ dễ dàng thu tế bào mục tiêu Trong đề tài này, tiến hành tạo hạt từ miễn dịch phịng thí nghiệm nhằm phân tách tế bào Jurkat T khỏi dịch nuôi tế bào Với đặc điểm tương tự tế bào lympho T khả tăng sinh mạnh, Jurkat T dịng tế bào mơ hình sử dụng Kháng thể kháng tế bào Jurkat T gắn định hướng lên bề mặt hạt từ thông qua protein A/G, protein bắt đặc hiệu vùng Fc kháng thể Sau đó, việc đánh giá khả phân tách hạt từ phịng thí nghiệm tiến hành thơng qua thử nghiệm bắt riêng lẻ tế bào Jurkat T VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Tạo hạt từ miễn dịch phịng thí nghiệm Tạo liên kết hạt từ protein A/G Liên kết cộng hóa hóa trị nhóm chức amin bề mặt hạt từ Fe3O4@SiO2-NH2 nhóm amin protein A/G tạo nhằm cố định protein A/G để gắn kết định hướng kháng thể kháng Jurkat T từ làm tăng khả phân tách tế bào Hạt từ protein A/G xử lý với SPDP Sau đó, hạt từ phản ứng với chất khử cầu nối disulfide để hình thành gốc -SH, hạt từ protein gắn với thông qua liên kết disulfide Sự hình thành liên kết kiểm tra phương pháp điện di SDS-PAGE, lượng protein A/G gắn hạt định lượng thông qua phương pháp Bradford Tạo liên kết hạt từ-A/G với kháng thể kháng tế bào Jurkat T Protein A/G protein dung hợp bao gồm bốn vùng bắt Fc IgG protein A hai vùng bắt Fc IgG protein G Do kháng thể gắn định hướng lên bề mặt hạt làm tăng cường khả phân tách tế bào hạt từ Tương tác protein A/G kháng thể kháng tế bào Jurkat T tương tác lực nên tương tác dễ bị đứt gãy thay đổi điều kiện môi trường pH, lực ion,… 107 Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Sự hình thành liên kết kiểm tra phương pháp điện di SDS-PAGE, lượng kháng thể gắn hạt định lượng thông qua phương pháp Bradford Thử nghiệm khả phân tách tế bào Hạt từ gắn kháng thể có lực cao với kháng nguyên diện diện tế bào Jurkat T, tế bào phân tách khỏi hỗn hợp tế bào ban đầu từ trường nam châm Lượng tế bào xác định thông qua phương pháp đếm tế bào buồng đếm hồng cầu với hỗ trợ dung dịch Trypan Blue Kỷ yếu khoa học KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tạo liên kết hạt từ protein A/G Trước gắn hạt từ với protein A/G, nồng độ protein sử dụng thời gian phản ứng khảo sát với protein A/G thay protein BSA Sau tiến hành khảo sát protein A/G gắn kết với hạt từ PTN nồng độ 40µg/ml thời gian phản ứng Kết SDS-PAGE nhằm đánh giá liên kết hạt từ PTN protein A/G thể Hình Hình Đánh giá khả gắn kết hạt từ PTN protein A/G phương pháp SDSPAGE Ghi chú: M: Thang; 1: Xử lý điều kiện không khử; 2: Xử lý điều kiện khử; 3: Protein A/G Kết cho thấy, có xuất vạch protein A/G (xấp xỉ 50,5kDa) giếng số tương đương với vạch protein giếng chứa protein A/G Ở giếng số 2, hạt không xử lý điều kiện khử khơng có vạch protein xuất Điều chứng tỏ protein A/G cố định bề mặt hạt từ thông qua liên kết cộng hóa trị hình thành nhờ chất xúc tác SPDP Đồng thời, kết gắn kết protein cho thấy, hạt từ PTN có khả gắn kết 85,72 ± 9,08 µg protein A/G mg hạt Gắn kết kháng thể lên hạt từ-A/G PTN Hạt từ-A/G PTN tiến hành ủ với kháng thể kháng bào Jurkat T Sau ủ với kháng thể, hạt từ rửa tiến hành dung ly, mẫu hạt từ trước sau dung ly dịch dung ly xử lý điện di SDS-PAGE Kết điện di thể Hình Hình Đánh giá khả bắt kháng thể hạt từ PTN A/G phương pháp SDS-PAGE Ghi chú: M: thang; 1: Protein A/G; 2: Kháng thể IgG; 3: Hạt từ-A/G PTN trước dung ly kháng thể; 4: Hạt từA/G PTN sau dung ly kháng thể; 5: Dịch dung ly kháng thể 108 Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Kỷ yếu khoa học Bảng Kết phân tách tế bào hạt từ miễn dịch PTN quần thể tế bào Jurkat T Số lượng tế bào (x105 tế bào) Jurkat T Nghiệm thức Lần Lần Lần Tổng tế bào trước phân tách 3,00 2,25 2,25 Pha dịch 1,5 1,00 1,00 Pha hạt 1,5 1,25 1,25 Số tế bào sau phân tách Kết cho thấy xuất vạch protein tương ứng với vạch kháng thể IgG thỏ (150kDa) bao gồm chuỗi nặng (50kDa) chuỗi nhẹ (25kDa) giếng chứa mẫu IgG đối chứng, giếng chứa hạt từ trước dung ly giếng chứa dịch dung ly Đồng thời, giếng chứa hạt từ sau dung ly không nhận thấy diện vạch protein tương ứng với chuỗi nặng chuỗi nhẹ kháng thể mà thấy vạch protein tương ứng với protein A/G Điều khẳng định diện kháng thể thỏ IgG bề mặt hạt từ Lượng kháng thể gắn bề mặt hạt từ định lượng phương pháp Bradford Kết định lượng cho thấy 1mg hạt từ gắn 21,87 ± 1,69µg kháng thể Đánh giá khả phân tách tế bào quần thể tế bào Hạt từ miễn dịch sau gắn với kháng thể ủ với tế bào Jurkat T để kiểm tra khả phân tách tế bào Kết đếm tế bào pha dịch pha hạt thể Bảng Lượng tế bào thu pha hạt tương đương với 53,3% so với tổng số tế bào trước phân tách (1,33 so với 2,5x105) Lượng tế bào có pha hạt khả phân tách tế bào hạt từ PTN Từ ta thấy hạt từ có khả phân tách tế bào khỏi quần thể tế bào Jurkat T với hiệu suất 53,3% Mặc dù hiệu suất chưa cao, thấp so với hiệu suất hạt từ thương mại gắn với kháng thể PTN 95,2%, nhiên cải thiện so với đề tài trước gần 16% Điều cho thấy tiềm việc cải tiến ứng dụng hạt từ PTN chức hóa với nhóm NH2 cho mục tiêu phân tách tế bào lympho T hỗn hợp tế bào gốc máu KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết nghiên cứu cho thấy tạo thành công hạt từ miễn dịch phịng thí nghiệm kháng tế bào Jurkat T hạt từ có khả nhận diện phân tách 53% tế bào Jurkat T Từ kết nghiên cứu cần phải cải tiến quy trình gắn protein lên hạt từ gắn kháng thể lên hạt từ nhằm nâng cao hiệu suất phân tách tế bào Đồng thời cần tiến hành thí nghiệm đánh giá khả phân tách hạt từ phịng thí nghiệm hỗn hợp tế bào Jurkat T tế bào gốc tạo máu Lời cám ơn: Tác giả xin gửi lời cám ơn chân thành đến PGS.TS Trần Văn Hiếu CN Huỳnh Kiến Quang hỗ trợ tác giả suốt trình thực đề tài Đề tài thực phịng thí nghiệm mơn Cơng nghệ Sinh học phân tử môi trường, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên – ĐHQG TP Hồ Chí Minh 109 Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Kỷ yếu khoa học TÀI LIỆU THAM KHẢO M A R N STEPHEN J FORMAN, MD, “Hematopoietic Cell Transplantation,” November 01, 2015 N Y VILLA, M M RAHMAN, G MCFADDEN, AND C R COGLE, “Therapeutics for Graft-versus-Host Disease: From Conventional Therapies to Novel Virotherapeutic Strategies,” Viruses, vol 8, p 85, Mar 22 2016 H V H TRỊNH MINH THƯỢNG, TẠ THỊ KIỀU HẠNH, TRẦN VĂN HIẾU, “Bước đầu thử nghiệm gắn kháng thể kháng CD3 lên hạt từ tính thơng qua protein A/G phục vụ phân tách tế bào T,” Tạp chí Khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội: Khoa học tự nhiên công nghệ, vol Tập 3, Số 4S (2015), pp 408-414, 2015 H T X M TRỊNH MINH THƯỢNG, TRẦN VĂN HIẾU, “Tạo thu nhận chọn lọc kháng thể IgG kháng protein màng tế bào T Jurkat,” Science & Technology Development, vol Vol 19, 2016 110 ... t? ?? bào trước phân t? ?ch (1,33 so với 2,5x105) Lượng t? ?? bào có pha h? ?t khả phân t? ?ch t? ?? bào h? ?t t? ?? PTN T? ?? ta thấy h? ?t t? ?? có khả phân t? ?ch t? ?? bào khỏi quần thể t? ?? bào Jurkat T với hiệu su? ?t 53,3%... đánh dấu đ? ?t t? ?? trường mạnh, t? ?? bào đánh dấu t? ?? trường di chuyển theo hướng có lượng t? ?? trường, t? ?? dễ dàng thu t? ?? bào mục tiêu Trong đề t? ?i này, tiến hành t? ??o h? ?t t? ?? miễn dịch phịng thí nghiệm... cho mục tiêu phân t? ?ch t? ?? bào lympho T hỗn hợp t? ?? bào gốc máu K? ?T LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ K? ?t nghiên cứu cho thấy t? ??o thành cơng h? ?t t? ?? miễn dịch phịng thí nghiệm kháng t? ?? bào Jurkat T h? ?t t? ?? có khả nhận