Đánh giá hiệu quả điều trị bệnh parkinson của cao chiết rau sam (Portulaca oleracea L.) trên mô hình ruồi giấm chuyển gene mang kiểu hình bệnh

Parkinson là một trong những bệnh thoái hóa thần kinh phổ biến với các biểu hiện về rối loạn vận động và chết tế bào thần kinh sinh dopamine ở vùng chất đen. Các nghiên cứu trước đây cho thấy, ruồi chuyển gene knockdown duch trên các tế bào thần kinh sinh dopamine biểu hiện các triệu chứng của bệnh Parkinson bao gồm suy giảm vận động và chết tế bào sinh dopamine.

Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Kỷ yếu khoa học ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ ĐIỀU TRỊ BỆNH PARKINSON CỦA CAO CHIẾT RAU SAM (PORTULACA OLERACEA L.) TRÊN MƠ HÌNH RUỒI GIẤM CHUYỂN GENE MANG KIỂU HÌNH BỆNH Trương Huỳnh Kim Thoa* Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh *Tác giả liên hệ: truongthoa139@gmail.com TĨM TẮT Parkinson bệnh thối hóa thần kinh phổ biến với biểu rối loạn vận động chết tế bào thần kinh sinh dopamine vùng chất đen Các nghiên cứu trước cho thấy, ruồi chuyển gene knockdown duch tế bào thần kinh sinh dopamine biểu triệu chứng bệnh Parkinson bao gồm suy giảm vận động chết tế bào sinh dopamine Các triệu chứng knockdown duch giảm bổ sung thêm hợp chất kháng oxi hóa curcumin hay vitamin C Các kết cho thấy tiềm sử dụng mơ hình ruồi knockdown duch sàng lọc chất kháng oxi hóa để điều trị bệnh Parkinson Trong nghiên cứu này, sử dụng ruồi knockdown duch nhằm mục đích kiểm tra khả sử dụng cao chiết từ rau sam (Portulaca oleracea L.) để điều trị bệnh Parkinson Kết thực nghiệm cho thấy cao chiết rau sam cải thiện triệu chứng suy thoái vận động knockdown duch gây ấu trùng ruồi mơ hình làm chậm tiến trình bệnh ruồi trưởng thành Đồng thời, mức độ tế bào, cao chiết rau sam cải thiện tình trạng thối hóa tế bào thần kinh sản sinh dopamine gây knockdown duch ruồi giấm Từ khóa: Bệnh Parkinson, mơ hình ruồi giấm, mơ hình ruồi knock-down duch, kháng oxy hóa, rau sam EFFECT OF PURSLANE EXTRACT (PORTULACA OLERACEA L.) ON ROSOPHILA MODEL OF PARKINSON’S DISEASE Truong Huynh Kim Thoa* University of Science – VNU Ho Chi Minh City *Corresponding Author: truongthoa139@gmail.com ABSTRACT Parkinson’s disease is one of the most common neurodegenerative disoder, which is characterized by progressive deterioration of motor function and loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra Previous studies showed that Drosophila which bearing dopaminergic neuron-specific knockdown of duch manifested PD’s symptoms including decreases in locomotor abilities and loss of dopaminergic neurons Noticeably, antioxidants such as curcumin and vitamin C improved these PD symptoms in the fly model These results demonstrated that duch-knockdown flies is a potential model for screening antioxidants which can be used for PD treatment In this study, we utilized duch-knockdown flies in order to evaluate capacity of purslane (Portulaca oleracea L.) extract in using for PD treatment The results showed that purslane extract could improve the locomotor abilities in the larval stage and decelerate disease’s progression in the adult stage Additionally, in cellular base, purslane extract could reduce DA neuron degeneration caused by knockdown of duch Keywords: Parkinson’s disease, Drosophila model, duch-knockdown Drosophila model, antioxidants, purslane Bệnh Parkinson có biểu lâm sàng rối loạn vận động run, cứng cử động chậm chạp, đồng thời có dấu hiệu chết tế bào thần kinh sinh dopamine vùng liềm đen, thuộc não Mô hình ruồi giấm có lịch sử lâu đời TỒNG QUAN Parkinson bệnh thối hóa thần kinh phổ biến người cao tuổi, với khoảng 3% dân số độ tuổi 65 mắc bệnh Bệnh có dấu hiệu trẻ hóa có mức độ gia tăng nhanh bệnh lý thần kinh 77 Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Kỷ yếu khoa học dung môi nước: mẫu bột nghiền rau sam trộn đều, ngâm dầm với nước cất hai lần, tỷ lệ m:v=1:15, sau ly tâm, thu dịch Dịch trích sấy khơ máy đông khô trữ lạnh -300C Cao chiết rau sam thêm vào môi trường nuôi ruồi thí nghiệm theo nồng độ khảo sát, dòng ruồi giấm knock-down duch (Kd) dòng đối chứng (Dc) Đánh giá tác động cao chiết lên sinh lý Sức ăn: Pha môi trường thường bổ sung cao chiết rau sam theo nồng độ thí nghiệm Comassive-G250 2% Bắt ấu trùng bậc sớm, cho ăn vòng 30 phút Thu ấu trùng rửa PBS, chuyển vào eppendorf 1,5ml mới, đồng hóa mẫu PBS Định lượng Commasive đo số OD bước sóng 595nm Lượng tồn dư chất kháng oxi hóa: Nghiền 50 cá thể ấu trùng bậc nồng độ cần khảo sát với 500 µl nước cất lần Ly tâm lạnh 4oC 20 phút, thu dịch Pha loãng tới nồng độ cần thiết Giữ lạnh tránh sáng Đặt phản ứng với DPPH 50µM 40 phút Đo OD bước song 517nm Xác định IC50 dòng theo độ pha loãng Đánh giá khả vận động ruồi giấm Các thí nghiệm vận động thực cá thể đực sinh sản ruồi ảnh hưởng đến khả vận động Thử nghiệm bò trườn: Đổ đĩa agar 2% Cho 3-4 cá thể ấu trùng bậc lên đĩa agar/lần, quay lại từ 1-2 phút, đảm bảo cho cá thể ấu trùng di động đặn 40s/đoạn phim Các đoạn phim xử lý với ImageJ, plugin wrMTrck để thu số liệu vận tốc, biểu đồ thống kê (One way-ANOVA) vẽ xử lý với GraphPad 6.01 Thử nghiệm leo trèo: Ruồi trưởng thành bắt ngày sau thoát kén Sử dụng khoảng 80-100 cá thể ruồi trưởng thành/dòng ruồi Chuẩn bị ống 12cm, chia vạch tính điểm, tính từ đáy vạch cách 1cm Gây mê, bắt vào ống 10 cá thể ruồi, dòng bắt đủ ống Đập theo chiều trọng lực lần, giữ yên 60 giây, lặp lại lần Quay phim lại toàn trình từ bắt đầu đập Kết đọc thơng qua số leo trèo tính tỉ lệ phần trăm cá thể vượt vạch 6cm lần đập Mỗi ống climbing ghi nhận số liệu Độ nghiên cứu sinh học nguyên giá trị Mang nhiều đặc điểm thuận lợi cho nghiên cứu vòng đời ngắn, số lượng nhiều, chi phí thấp, có mức độ tương đồng định so với người (75% gene bệnh người có gene tương đồng ruồi), mơ hình ruồi giấm mơ hình tiềm cho sàng lọc thuốc invivo sơ cấp Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase L1 (UCH-L1) protein hoạt động hệ thống phân hủy protein Ubiquitin proteasome, biểu nhiều não biết có liên quan đến bệnh Parkinson Ở ruồi giấm, gene tương đồng với uch-l1 duch, với mức độ tương đồng trình tự khoảng 46% Các nghiên cứu trước chúng tơi cho thấy, dịng ruồi chuyển gene làm knockdown duch tế bào thần kinh sinh dopamine biểu triệu chứng bệnh Parkinson bao gồm suy giảm vận động chết tế bào thần kinh sản sinh dopamine Ngoài ra, bổ sung thêm hợp chất kháng oxi hóa curcumin, vitamin C vào mơi trường nuôi ruồi, triệu chứng knockdown duch cải thiện Từ đó, chúng tơi nhận thấy UCH-L1 có liên quan tới stress oxi hóa tế bào, đồng thời, mơ hình ruồi knockdown duch mơ hình tiềm sàng lọc chất kháng oxi hóa để điều trị bệnh Parkinson Nhiều công bố khoa học trước cho thấy rau sam (Portulaca oleracea L.) thực vật có nhiều thành phần kháng oxi hóa vitamin A, vitamin C, acid béo omega-3, flavonoid hay alkaloid Bên cạnh đó, rau sam chứa dopamine levodopa (tiền chất dopamine), chất dẫn truyền thần kinh có liên quan mật thiết đến bệnh Parkinson Nhằm mục đích khảo sát khả sử dụng rau sam ứng viên thuốc điều trị Parkinson, nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành thí nghiệm khảo sát tác động cao chiết rau sam lên mơ hình ruồi knockdown duch mang kiểu hình bệnh Parkison VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Phương pháp chiết cao rau sam Rau sam (Portulaca oleracea L.) thu hái đông khô đến khơ hồn tồn Trọng lượng mẫu sau đơng khơ xác định, xay nhuyễn Chiết cao rau sam 78 Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 suy giảm khả vận động tính gốc đường tuyến tính qua giá trị trung bình theo ngày dòng Biểu đồ vẽ GraphPad 6.01 Định lượng tế bào thần kinh sinh dopamine Tách mô não cần nhuộm (não ấu trùng bậc 3, não ruồi trưởng thành) PBS lạnh Cố định mô với para-formaldehit 4% Nhuộm miễn dịch với kháng thể bậc kháng tyroxyl hydroxylase, kháng thể bậc gắn chất phát huỳnh quang Kết ghi nhận kính hiển vi huỳnh quang Nikon Kỷ yếu khoa học ECLIPSE NI-U độ phóng đại 100X Lượng tế bào đếm thủ cơng với phần mềm ImageJ, thu kết Microsoft Excel, xử lý thống kê (One-way ANOVA) vẽ biểu đồ phần mềm GraphPad 6.01 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Ảnh hương cao chiết rau sam tới trình sinh lý ruồi giấm Sức ăn: Cao chiết rau sam có xu hướng làm tăng khả ăn ấu trùng hai dòng Kd Dc, nồng độ cao, lượng thức ăn tiêu thụ lớn Hình A: Biểu đồ tác động cao chiết rau sam lên sức ăn ấu trùng bậc ba dòng đối chứng dòng knockdown duch B: Lượng chất kháng oxi hóa hấp thu tính theo lượng thức ăn so với dịng Dc+1.25mM (thí nghiệm lặp lại lần, 10 cá thể cho lần khảo sát, Oneway ANOVA test, ** p