Thử nghiệm tạo hạt từ miễn dịch phân tách tế bào lympho T ứng dụng trong ghép tủy

Trong nghiên cứu này, hạt nano từ tính được gắn với kháng thể kháng tế bào T nhằm tạo hạt từ miễn dịch phân tách tế bào Jurkat T ra khỏi môi trường nuôi cấy. Kháng thể được gắn định hướng lên bề mặt hạt từ -NH2 thông qua liên kết với protein A/G, một protein có khả năng bắt đặc hiệu vùng Fc của kháng thể.

Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học THỬ NGHIỆM TẠO HẠT TỪ MIỄN DỊCH PHÂN TÁCH TẾ BÀO LYMPHO T ỨNG DỤNG TRONG GHÉP TỦY Trần Văn Thuận* Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh *Tác giả liên lạc: singapore379@gmail.com TĨM TẮT Hiện nay, biến chứng vật ghép chống chủ (GVHD) rào cản lớn ứng dụng ghép tủy đồng loài điều trị bệnh ung thư máu, gây tế bào T người cho cơng tế bào người nhận Do đó, loại bỏ tế bào T trước cấy ghép điều cần thiết Kỹ thuật phân tách tế bào dựa vào từ tính (MACS) để loại bỏ tế bào lympho T giải pháp hiệu nhằm ngăn ngừa GVHD Trong nghiên cứu này, hạt nano từ tính gắn với kháng thể kháng tế bào T nhằm tạo hạt từ miễn dịch phân tách tế bào Jurkat T khỏi môi trường nuôi cấy Kháng thể gắn định hướng lên bề mặt hạt từ -NH2 thông qua liên kết với protein A/G, protein có khả bắt đặc hiệu vùng Fc kháng thể SPDP sử dụng để tạo cầu nối cộng hóa trị gốc amine bề mặt hạt từ protein A/G Hạt nano từ tính có khả gắn 71 μg protein A/G, 26 μg kháng thể mg hạt từ Hạt từ miễn dịch phân tách 85,56% riêng lẻ tế bào Jurkat T Từ khóa: Hạt nano, hạt từ miễn dịch, phân tách tế bào lympho T, ghép tủy, protein A/G, kháng thể kháng tế bào T ASSAY OF PRODUCING IMMUNOMAGNETIC NANOPARTICLES TO REMOVE T CELLS FOR APPLICATION OF BONE MARROW TRANSPLANTATION Tran Van Thuan* University of Science – VNU Ho Chi Minh City *Corresponding Author: singapore379@gmail.com ABSTRACT Currently, Graft-Versus-Host Disease (GVHD) is the major barrier to allogeneic bone marrow transplantation for hematopoietic disorders treatment, caused by undesired responses of donor’s T cells to the recipient’s cells Therefore, T cell depletion prior to transplant is unmet need Magnet-Activated Cell Sorting (MACS) for T cells removal is one of the most effective methods to prevent GVHD In this study, magnetic nanoparticles were conjugated with anti-T cell antibodies to produce immunomagnetic particles for separation of Jurkat T cells from cell culture medium Anti-Jurkat T antibodies were oriented on -NH2 magnetic nanoparticles’ surface through recombinant protein A/G, which is an antibody’s Fc binding protein SPDP formed a covalent bound between amine groups on the particle’s surface and amine groups of protein molecules Approximately, 71 μg of protein A/G and 26 μg of antibody were immobilized on one mg of magnetic beads The immunomagnetic nanoparticles could remove 85.56% of Jurkat T cells from cell culture Keywords: Nanoparticles, immunomagnetic nanoparticles, T cell depletion, bone marrow transplantation, protein A/G, anti-T cell antibodies 140 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 TỔNG QUAN Ngày nay, vật liệu nano ngày quan tâm ứng dụng nhiều lĩnh vực, đặc biệt lĩnh vực y sinh học Điều mở thêm nhiều giải pháp hiệu để giải vấn đề tồn đọng nghiên cứu lẫn lâm sàng Trong ứng dụng hạt nano, ứng dụng phân tách tế bào ứng dụng tiêu biểu hạt nano từ tính y sinh học (Corchero and Villaverde 2009, Shubayev, Pisanic II et al 2009) Kỹ thuật phân tách tế bào dựa vào từ tính (Magnet-Activated Cell Sorting – MACS) kỹ thuật phân tách dựa đặc điểm sinh hóa tế bào So sánh với kỹ thuật phân tách khác, MACS có tính chọn lọc độ đặc hiệu cao tương tác đặc hiệu kháng thể dấu ấn bề mặt tế bào Đồng thời, MACS có tốc độ phân tách nhanh, dễ dàng thu hồi tế bào sau phân tách, thao tác đơn giản không tốn so với phương pháp dựa đặc điểm sinh hóa khác như: cột sắc kí lực đánh dấu huỳnh quang (Plouffe, Murthy et al 2014) Với đặc điểm trên, MACS sử dụng phổ biến việc phân tách tế bào T cấy ghép tủy xương, hỗ trợ điều trị bệnh lý liên quan đến huyết học Ghép tủy phương pháp sử dụng tế bào gốc máu khỏe mạnh để thay tế bào gốc hư hỏng Đến phương pháp ghép tủy xương với xạ trị, hóa trị mang lại niềm hi vọng cho bệnh nhân mắc bệnh huyết học (ung thư bạch cầu/leukemia, ung thư lympho bào/lymphoma, ung thư tế bào dòng tủy/myeloma, ), di truyền, suy giảm miễn dịch, bệnh ung thư khác Dựa vào đối tượng cho tế bào gốc tạo máu, ghép tủy chia làm hai loại ghép tủy tự thân ghép tủy đồng lồi Trong đó, ghép tủy đồng lồi ngày quan tâm bệnh nhân hồi phục hoàn Kỷ yếu khoa học tồn bị tái phát lại sau cấy ghép Tuy nhiên, trở ngại lớn cấy ghép đồng lồi biến chứng vật ghép chống chủ (Graft-Versus-Host Disease – GVHD) sau cấy ghép, gây nhiều hậu nghiêm trọng dẫn đến tử vong Theo nhiều nghiên cứu gần cho thấy, diện tế bào lympho T tủy ghép nguyên nhân dẫn đến đáp ứng miễn dịch bất lợi gây tổn thương nghiêm trọng người nhận tủy ghép (Ferrara, Levine et al 2009) Vì vậy, việc loại bỏ tế bào lympho T tủy ghép điều cần thiết nhằm ngăn ngừa GVHD Tại Việt Nam, việc nghiên cứu phát triển kỹ thuật MACS cấy ghép tủy xương quan tâm Đi đầu nghiên cứu hạt từ miễn dịch nước, trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia TP.HCM thực đề tài nghiên cứu “Bước đầu xây dựng quy trình ứng dụng hạt nano từ tính Fe3O4@SiO2 để loại bỏ tế bào lympho T” Bộ môn Công nghệ Sinh học Phân tử Môi trường phối hợp với Bộ môn Vật liệu từ Y sinh thực đạt kết định Tuy nhiên, hiệu phân tách hạt từ miễn dịch chưa cao, chưa thể áp dụng cho nghiên cứu sâu sau (Ta, Trinh et al 2016) Do mục tiêu đề tài hướng đến tạo hạt từ miễn dịch có khả phân tách tế bào đạt hiệu cao hạt từ có nhóm chức –NH2 bề mặt thay nhóm –CDI trước Đề tài nghiên cứu gồm có hai nội dung thực nối tiếp sau: tạo hạt từ miễn dịch với quy trình có thông số tối ưu; đánh giá khả phân tách tế bào quần thể tế bào Jurkat T Hạt từ miễn dịch tạo thành cách cố định vùng Fc kháng thể kháng tế bào T lên bề mặt hạt từ -NH2 thông qua protein A/G Protein A/G tạo liên kết cộng hóa trị với hạt từ -NH2 141 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 thông qua SPDP (N-succinimidyl 3-(2pyridyldithio) propionate)- nhân tố tạo cầu nối hóa học sử dụng để tạo liên kết cộng hóa trị hai nhóm -NH2 có liên kết S-S (disulfide) cắt dithiothreitol (DTT) chất khử khác tạo thành gốc chức -SH đầu phân tử Sau đó, hạt từ miễn dịch đánh giá khả phân tách riêng lẻ tế bào lympho T quần thể tế bào NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu Hạt nano từ tính Fe3O4@SiO2-NH2 sử dụng đề tài cung cấp môn Vật liệu từ Y sinh, khoa Khoa học Vật liệu, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG TP.HCM Protein A/G (cung cấp Bio basic Inc.) gắn lên hạt từ SPDP (cung cấp SigmaAldrich) nhằm cố định định hướng kháng thể kháng protein CD3 lên hạt từ Kháng thể kháng CD3 thử nghiệm phân tách tế bào T kháng thể đa dịng cung cấp Bộ mơn Cơng nghệ Sinh học Phân tử Môi trường Tế bào Jurkat T (nguồn gốc từ ATCC) dịng tế bào mơ hình sử dụng để đánh giá khả phân tách riêng lẻ tế bào T hạt từ miễn dịch nuôi môi trường RPMI-1640 (mua từ Himedia) chứa 10% FBS (cung cấp Sigma-Aldrich) điều kiện 37oC, 5% CO2 Phương pháp Tối ưu thông số gắn protein lên hạt từ Do giới hạn protein A/G, nghiên cứu sử dụng protein BSA thay q trình khảo sát Hịa 0,25 mg hạt nano từ tính vào ml dung dịch phosphate buffer saline chứa 150 mM NaCl, mM EDTA, 0,02% sodium azide (pH 7,5) Sau đó, hạt từ cho phản ứng với lượng SPDP khác (10, 20, 30, 40, 50 μg) 30 60 phút xử lý dithiothreitol (DTT) 50 mM Kỷ yếu khoa học 30 phút Tiếp theo, hạt từ đảo 40 μg/ml BSA phản ứng với 7,25 μg SPDP 18h nhiệt độ khảo sát (10°C 25°C) Phần hạt từ phần dịch sau phản ứng tách nam châm Sử dụng dung dịch glycine (pH 2,5) rửa phần hạt nhằm loại protein liên kết yếu với hạt từ Liên kết hạt từ protein BSA đánh giá SDS-PAGE Tạo liên kết hạt từ protein A/G Protein A/G gắn với hạt từ dựa theo thông số tối ưu khảo sát thí nghiệm gắn protein BSA hạt từ với qui trình tương tự Sau đó, liên kết hạt từ protein A/G đánh giá SDSPAGE Lượng protein A/G liên kết với hạt từ (M) định lượng gián tiếp phương pháp Bradford tương tự với công thức (1) Tạo hạt từ miễn dịch Kháng thể đa dòng kháng CD3 pha dung dịch tris-buffered salin with Tween20 (TBST) nồng độ 10, 30, 50, 70, 90 μg/ml cho đảo nhẹ với 0,25 mg hạt từ-pA/G 1h 4°C Sau đó, phần hạt tách nam châm rửa TBST Dung ly kháng thể khỏi hạt từ-pA/G dung dịch glycine (pH 2,5) Dịch dung ly trung hòa Tris-HCl (pH 9) với tỷ lệ 10:1 tổng lượng kháng thể gắn lên mg hạt từpA/G (XG) định lượng trực tiếp phương pháp Bradford Đánh giá khả phân tách riêng lẻ tế bào Jurkat T hạt từ miễn dịch Chuẩn bị tế bào Jurkat T dịch phosphat buffer saline (PBS) chứa 1% BSA mM EDTA vào với lượng xấp xỉ 3x105 tế bào/ml Hòa ml tế bào vào eppendorf chứa 0,25 mg hạt từ miễn dịch, huyền phù đảo điều kiện 25oC 40 phút Dùng nam châm để tách hỗn hợp thành hai pha: Pha hạt pha dịch, hút pha dịch vào eppendorf khác Tiến hành đếm tế bào pha dịch buồng đếm hồng cầu với dung dịch Trypan Blue 142 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Lượng tế bào pha hạt hiệu số số tế bào ban đầu trừ cho số tế bào pha dịch Khả phân tách tế bào hạt từ miễn dịch tính dựa phần trăm tế bào pha hạt so với tổng Kỷ yếu khoa học số tế bào ban đầu KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tối ưu thông số gắn protein lên hạt từ Hình Lượng BSA gắn lên mg hạt từ theo thông số khảo sát (μg) a Khảo sát thời gian hoạt hóa hạt từ SPDP 30, 60 phút; b Đánh giá khả hoạt hóa hạt từ SPDP; c Khảo sát nhiệt độ phản ứng protein BSA hạt từ 10°C 25°C Số lượng protein BSA gắn mg hạt từ xử lý phương pháp thống kê t-test không bắt cặp cho thấy: lượng protein gắn lên hạt từ có khác biệt có ý nghĩa thống kê hạt từ hoạt hóa với SPDP 30 60 phút (a) ; khơng có khác biệt năm thơng số SPDP hoạt hóa hạt từ (b) điều kiện nhiệt độ phản ứng BSA với hạt từ (c) Lượng protein gắn với hạt từ hoạt hóa 30 60 phút 33,98 ± 2,47μg 23,82 ± 2,80μg Điều lí giải ổn định của SPDP dung môi phân cực Vì vậy, thời gian phản ứng với hạt từ lâu dẫn đến khả phân hủy chúng lớn, khơng có gia tăng hiệu suất phản ứng SPDP hạt từ Nhằm nâng cao lượng protein gắn lên hạt từ tiết kiệm lượng SPDP phản ứng, hạt từ hoạt hóa với 10 μg SPDP thời gian 30 phút chọn cho thí nghiệm Đồng thời, điều kiện nhiệt độ phản ứng protein hạt từ thực 25°C, nhiệt độ tiêu chuẩn phịng thí nghiệm nói chung phịng thí nghiệm cấy ghép nói riêng nên dễ dàng áp dụng điều kiện không cần sử dụng biện pháp làm lạnh Tạo liên kết hạt từ protein A/G Liên kết protein A/G hạt từ kiểm tra phương pháp SDS-PAGE cho kết tương đồng với kết hạt từ gắn với protein BSA (Hình 2) Ở giếng (chứng âm) giếng (mẫu không xử lý DTT) vạch protein, giếng (mẫu có xử lý DTT) có xuất vạch xấp xỉ 50,5 kDa với vạch protein A/G giếng Điều chứng tỏ, protein 143 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 A/G gắn kết với hạt từ thơng qua liên kết cộng hóa trị S-S Sau kiểm tra liên kết protein A/G hạt từ, thông Kỷ yếu khoa học qua phương pháp định lượng Bradford, lượng protein A/G gắn lên 1mg hạt từ đạt 71,29 ± 7,87 μg Hình Đánh giá gắn kết protein A/G hạt từ phương pháp SDS-PAGE M thang; chứng âm; mẫu xử lý với điều kiện khử; mẫu xử lý điều kiện không khử; protein A/G Tạo hạt từ miễn dịch Liên kết hạt từ-pA/G với kháng thể đánh giá SDS-PAGE cho thấy, kháng thể liên kết với A/G tạo thành hạt từ miễn dịch Liên kết bị phá hủy dịch dung ly có pH thấp Lượng kháng thể định lượng trực tiếp Bradford Kết lượng kháng thể gắn lên hạt từ nồng độ khác thể Hình Hình Khảo sát nồng độ kháng thể gắn mg hạt từ-pA/G Hình thể lượng kháng thể gắn lên đến lượng kháng thể gắn lên hạt từ pA/G mg hạt từ-pA/G theo năm giá trị nồng không tăng theo nồng độ kháng thể độ kháng thể khác 10, 30, 50, 70, phản ứng Từ biểu đồ này, nồng độ kháng 90 μg/ml Kết cho thấy lượng kháng thể 10 μg/ml gắn 25,94 ± 3,74 μg thể khơng có chênh lệch mặt kháng thể lên mg hạt từ-pA/G thống kê Nguyên nhân lượng sử dụng để tạo hạt từ miễn dịch thử protein A/G gắn kết bề mặt hạt bị giới nghiệm khả phân tách tế bào Jurkat hạn Khi đó, số protein A/G tương T thí nghiệm nhằm giảm lượng tác với lượng kháng thể định dẫn kháng thể sử dụng 144 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 KẾT LUẬN Nghiên cứu tìm lượng SPDP hoạt hóa thời gian hoạt hóa hạt từ tối ưu 10μg 30 phút, 25°C nhiệt độ thích hợp để gắn protein A/G lên bề mặt hạt từ -NH2 Ở điều kiện tối ưu này, hạt từ gắn 71,29 ± 7,87 μg protein A/G mg hạt Sau đó, hạt từ-pA/G cho phản ứng với nồng độ kháng thể Kỷ yếu khoa học phù hợp 10 μg/ml Kết quả, 25,94 ± 3,74 μg kháng thể cố định lên bề mặt mg hạt từ-pA/G Hạt từ miễn dịch tạo thành có khả phân tách 85,56% riêng lẻ tế bào Jurkat T từ môi trường nuôi cấy So với đề tài trước đó, hiệu suất phân tách hạt từ miễn dịch cải thiện đáng kể, từ 53,3% lên 85,56% TÀI LIỆU THAM KHẢO CORCHERO, J L AND A VILLAVERDE (2009) Biomedical applications of distally controlled magnetic nanoparticles Trends in biotechnology 27(8): 468476 FERRARA, J L., J E LEVINE, P REDDY AND E HOLLER (2009) Graft-versushost disease The Lancet 373(9674): 1550-1561 PLOUFFE, B D., S K MURTHY AND L H LEWIS (2014) Fundamentals and application of magnetic particles in cell isolation and enrichment: A review Reports on Progress in Physics 78(1): 016601 SHUBAYEV, V I., T R PISANIC II AND S JIN (2009) Magnetic nanoparticles for theragnostics Advanced drug delivery reviews 61(6): 467-477 TA, T K H., M.-T TRINH, N V LONG, T T M NGUYEN, T L T NGUYEN, T L THUOC, B T PHAN, D MOTT, S MAENOSONO AND H TRANVAN (2016) Synthesis and surface functionalization of Fe3O4-SiO2 core-shell nanoparticles with 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane and 1, 1′carbonyldiimidazole for bio-applications Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects 504: 376-383 145 ... phân t? ?ch h? ?t t? ?? miễn dịch chưa cao, chưa thể áp dụng cho nghiên cứu sâu sau (Ta, Trinh et al 2016) Do mục tiêu đề t? ?i hướng đến t? ??o h? ?t t? ?? miễn dịch có khả phân t? ?ch t? ?? bào đ? ?t hiệu cao h? ?t t? ??. .. t? ?? Liên k? ?t h? ?t t? ?? protein BSA đánh giá SDS-PAGE T? ??o liên k? ?t h? ?t t? ?? protein A/G Protein A/G gắn với h? ?t t? ?? dựa theo thông số t? ??i ưu khảo s? ?t thí nghiệm gắn protein BSA h? ?t t? ?? với qui trình t? ?ơng... Sinh học Phân t? ?? Môi trường T? ?? bào Jurkat T (nguồn gốc t? ?? ATCC) dịng t? ?? bào mơ hình sử dụng để đánh giá khả phân t? ?ch riêng lẻ t? ?? bào T h? ?t t? ?? miễn dịch nuôi môi trường RPMI-1640 (mua t? ?? Himedia)