Nghiên cứu hoạt tính sinh học định hướng phân lập hợp chất tinh khiết từ cây nhân trần tía và ứng dụng

Mục đích của nghiên cứu là đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro, in vivo và chống tăng đường huyết của nhân trần tía. Ba loại cao chiết chloroform, cao chiết ethanol và cao chiết nước của cây được đánh giá trên các mô hình chống oxy hóa FRAP (ferric reducing/antioxidant power), quét gốc tự do DPPH (1,1- diphenyl-2-picryl-hydrazyl) và ức chế enzyme xanthin oxidase.

Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC ĐỊNH HƯỚNG PHÂN LẬP HỢP CHẤT TINH KHIẾT TỪ CÂY NHÂN TRẦN TÍA VÀ ỨNG DỤNG Nguyễn Ngọc Hồng*, Lương Thị Ngọc Hân, Phạm Tiến Đạt, Trương Hồng Nhung Trường Đại học Cơng nghệ TP Hồ Chí Minh *Tác giả liên lạc: nnhong@hutech.edu.vn TÓM TẮT Cây nhân trần tía Adenosma bracteosum Bonati dùng y học cổ truyền để trị bệnh gan mật có nghiên cứu hoạt tính sinh học khác Mục đích nghiên cứu đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro, in vivo chống tăng đường huyết nhân trần tía Ba loại cao chiết chloroform, cao chiết ethanol cao chiết nước đánh giá mơ hình chống oxy hóa FRAP (ferric reducing/antioxidant power), quét gốc tự DPPH (1,1diphenyl-2-picryl-hydrazyl) ức chế enzyme xanthin oxidase Kết phân tích cho thấy cao cồn cao nước có hoạt tính chống oxy hóa mạnh Kết định lượng phenol tổng cho kết cao chiết cồn có hàm lượng cao Các liều thử khác cao chiết cồn nước chuột bị tăng đường huyết đường uống cho kết liều dùng thấp cao cồn (40 mg/kg) cao nước (50 mg/kg) tương đương với nhóm đối chứng dùng thuốc glibenclamide Hoạt tính chống tăng đường huyết cao chiết cồn chuột bị gây độc streptozotocin tương đương với nhóm chứng thuốc Từ phân lập hợp hợp chất tự nhiên 5,7-Dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4-oxo-4H-chromen-8-yl hexopyranoside từ cao chiết cồn thu nhận phương pháp sắc ký cột, cấu trúc hợp chất xác định phổ NMR phổ MS Hợp chất có khả làm giảm lượng đường máu chuột tăng đường huyết đường uống Những kết thu nghiên cứu chứng minh nhân trần tía nguồn chất chống oxy hóa tự nhiên, ngăn ngừa bệnh gout chống tăng đường huyết nên hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường Ngồi nhóm tác giả bước đầu xây dựng qui trình sản xuất sản phẩm trà túi lọc từ Nhân trần tía Từ khóa: A.bracteosum, cao chiết, streptozotocin, chống tăng đường huyết, hoạt tính chống oxy hóa RESEARCH ON BIOLOGIC ACTIVITY AND NATURAL COMPOUND ISOLATION FROM ADENOSMA BRACTEOSUM BONATI AND APPLICATION Nguyen Ngoc Hong*, Luong Thi Ngoc Han, Pham Tien Đat, Truong Hong Nhung Ho Chi Minh City University of Technology *Corresponding Author: nnhong@hutech.edu.vn ABSTRACT Adenosma bracteosum Bonati has been used in traditional and folk medicine in Vietnam as a treatment for liver disease but there are little reports about its biological activities The aim of the present study was to evaluate antioxidant and anti-hyperglycemic activities of extracts from A bracteosum The chloroform, 24 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học ethanolic and aqueous extracts of A bracteosum were tested for their antioxidant activity by using ferric reducing/antioxidant power assay (FRAP) and 1,1diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) free radical scavenging assays, and the xanthine oxidase inhibitory activity of these extracts also were carried out The results showed that ethanolic and aqueous extracts possessed strong in vitro antioxidant capacity This study was also found that ethanolic extract had stronger than total phenolic content that of their chloroform and aqueous ones Different doses of ethanolic extract and aqueous extract were treated by oral tolerance to mice body before oral glucose tolerance The results indicated that inhibition percentage of ethanolic (at the dose of 40 mg/kg) and aqueous (at the dose of 50 mg/kg) extracts of A bracteosum in glucose-induced hyperglycemic mice were effectively similar to standard drug Glibenclamide The antihyperglycemic activity of ethanolic extract in streptozotocin-induced diabetic mice were effectively similar to standard drug Glibenclamide (p> 0.05) From ethanolic extract, we have isolated a flavonoid which was identified as 5,7Dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4-oxo-4H-chromen-8-yl hexopyranoside by using Nuclear magnetic resonance (1H-NMR, 13C-NMR, 2D-NMR) and Mass spectrometry Isolated compound also exhibited significant antihyperglycemic activity in glucose-induced hyperglycemia mice The results obtained indicate that A bracteosum is a potential antioxidant, anti-gout and anti-hyperglycemic agent The Authors have initially designed a production process of tea bag from A bracteosum Bonati Keywords: A bracteosum, streptozocin, antioxidant activity, anti-hyperglycemic activity Ngồi ra, có chứa tinh dầu với thành phần thymol với diện carvacrol nên có khả kiểm sóa t phòng chống bệnh nhiễm khuẩn, ho, hen suyễn (Tsankova et al., 1994, Can Baser K.H, 2008) Tuy nhiên, chưa có nhiều cơng trình nghiên cứu nhân trần tía Mục đích nghiên cứu nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa in vitro, in vivo tác dụng chống tăng đường huyết nhân trần tía TỒNG QUAN Bệnh tiểu đường xem bệnh mãn tính phổ biến tồn giới Trong trình tăng đường huyết thể sản sinh nhiều gốc tự làm suy yếu hệ thống phịng thủ chống oxy hóa nội sinh (Maritim A.C et al., 2003) Các loài thực vật chứa nguồn chất chống oxy hóa tự nhiên việc trì sức khỏe bảo vệ thể khỏi nhiều loại bệnh có bệnh tiểu đường Cây nhân trần tía Adenosma bracteosum Bonati thuộc họ Scrophulariaceae loại thân thảo, có mùi thơm trồng mọc hoang Campuchia, Lào miền Nam Việt Nam Cây nhân trần tía sử dụng dân gian vị thuốc với tác dụng hỗ trợ tiêu hóa, lợi mật, tiêu độc, lợi tiểu, chữa cảm cúm, táo bón, bệnh vàng da, (Đỗ Tất Lợi, 2004) NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu Cây tươi (phần mặt đất) thu hái vào tháng 11 tỉnh Tây Ninh Nguyên liệu rửa sạch, đem phơi sấy khô nhiệt độ 55-600C Nguyên liệu sau khô đạt độ ẩm 25 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 yêu cầu, đem xay nhỏ cỡ 1×1 mm làm nguyên liệu cho trình chiết thu cao Phương pháp nghiên cứu Phương pháp định tính thành phần hóa thực vật mẫu: Được thực theo quy trình mơ tả Ciulei có số thay đổi Đại học Y dược TP.HCM (Trần Hùng, 2004) Phương pháp chống oxy hóa in vitro FRAP: Tiềm chống oxy hóa cao chiết xác định khả khử Fe3+ qua phương pháp FRAP (Ferric reducing antioxidant power assay) theo quy trình mơ tả Benzie Strain (1996) Phương pháp quét gốc tự in vitro DPPH: Được xác định qua việc sử dụng mơ hình đề nghị Von Gadow et al (1997) Phương pháp ức chế enzym xanthin oxidase: Được xác định qua việc sử dụng mơ hình đề nghị Umamaheswari et al (2007) Allopurinol dùng làm chất chuẩn Phương pháp đánh giá khả chống tăng đường huyết: Nghiên cứu thực mô tả trước Rahman et al (2011) Những chuột bạch đực chia làm nhóm (6 nhóm) Nhóm (nhóm chứng trắng) chuột bình thường Nhóm (chuột tăng đường huyết) chuột uống đường với 2g glucose/kg Nhóm (nhóm chứng thuốc) chuột uống thuốc với thành phần glibenclamide (10 mg/kg ) đường với 2g glucose/kg Nhóm đến nhóm (nhóm 4, dùng Et; nhóm 7, dùng cao chiết AQ): chuột cho uống cao chiết Et AQ liều tương ứng 30, 40 50 mg/kg đường với 2g glucose/kg Các mẫu máu thu nhận hai sau uống glucose lượng đường máu đo phương pháp glucose oxidase Kỷ yếu khoa học Phương pháp khảo sát mơ hình in vivo chuột bị gây tiểu đường streptozocin: Tạo mơ hình chuột tiểu đường type phương pháp mô tả Kenneth et al (2008) tham khảo mô hình Nguyễn Trung Qn (2009) có thay đổi liều thử: chuột gây bệnh tiểu đường cách tiêm phúc mạc bụng chuột liều 150 mg.kg-1 streptozocin (STZ), hòa tan đệm citrate 0,1M lạnh, pH 4,5; sau tiêm, nước cho chuột uống thay dung dịch glucose 5% Nhóm đối chứng chuột tiêm đệm citrate Sau ngày tiêm STZ, chuột có nồng độ glucose máu lúc đói 14 mmol/L coi tiểu đường đưa vào nghiên cứu Sau tạo mơ hình chuột tiểu đường type thành công, tiến hành với số lượng lớn để thử nghiệm hoạt tính chống tăng đường huyết mẫu cao chiết chuột gây tiểu đường chọn, thực mô tả Rucha et al (2010) Các chuột phân thành nhóm, nhóm Nhóm chuột bình thường uống DMSO 1% nước cất Nhóm chuột bệnh tiểu đường uống DMSO 1% nước cất Nhóm chuột bị bệnh tiểu đường uống thuốc đặc trị glibenclamide (10 mg.kg-1) Nhóm 4, nhóm nhóm thử chuột bệnh tiểu đường cho uống cao Et cao AQ nhân trần với liều 40 mg.kg-1 cao Et liều 50 mg.kg-1 cao AQ Mỗi nhóm cho cho uống mơ tả đặn ngày 21 ngày, đo lượng đường máu, đặn tuần lần, chuột cho nhịn ăn đêm trước đo Phương pháp phân lập chất từ cao Et sắc ký cột cổ điển Pha tĩnh: Silica gel loại dùng cho sắc ký cột Merck, cỡ hạt 0.040 – 0,063 mm 26 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học Pha động: Hệ dung mơi thăm dị dung mơi thích hợp, lọc qua phễu thủy sắc ký lớp mỏng, chọn hệ dung tinh xốp, rửa dung môi lạnh để mơi thích hợp cho vết cần tách có thu chất tinh khiết làm Rf khoảng 0,25 - 0,35 khô tủ sấy chân không Nhồi cột ổn định cột: Chất hấp phụ Phương pháp xác định độ tinh khiết nhồi vào cột phương pháp định danh: Xác định độ tinh khiết bột ướt Ổn định cột dòng dung sắc ký lớp mỏng dùng mỏng tráng môi qua cột Thể tích dung mơi dùng sẵn Silica gel F254 Merck Chất sau cho ổn định cột gấp - lần thể tích phân lập mang định chất hấp phụ danh phương pháp phổ khối Nạp mẫu triển khai cột: Mẫu cộng hưởng từ hạt nhân nạp vào cột dạng bột khô lớp dung môi ổn định vừa rút khỏi mặt chất KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN hấp phụ Kết phân tích sơ thành phần Kiểm tra phân đoạn: Các phân đoạn hóa học thực vật nguyên liệu sắc ký lớp mỏng, phát Kết phân tích sơ thành phần hóa thuốc thử VS Gộp phân đoạn có học thực vật nhân trần tía cho thấy thành phần giống nhau, áp suất ngun liệu có nhóm hoạt chất để thu dịch đậm đặc polyphenol, flavonoid, triterpenoid, Các chất phân lập từ phân steroid, saponin nhiều tinh dầu đoạn cao Et kết tinh lại (bảng 1) Bảng Kết phân tích sơ thành phần hóa học nhân trần tía Nhóm hợp chất Ghi Kết Carotenoid Phản ứng Carr-Price ± Triterpenoid Phản ứng Liebermann- + Burchard Tinh dầu Mùi thơm + Flavonoid Mg/ HCl đậm đặc + Hợp chất polyphenol FeCl3 5% + Saponin Lắc mạnh với dung dịch nước + Alkaloid Mayer/ Dragendroff/ Wager Anthraquinone glycoside Borntrager Steroid Salkowski + Ghi chú: (-): Khơng có, (±): Nghi ngờ, (+): Có Hoạt tính chống oxy hóa in vitro mẫu theo mô hình FRAP Bảng Hoạt tính chống oxy hóa theo mơ hình FRAP, DPPH ức chế enzyme XO mẫu IC50 IC50 Mẫu FRAP(μmol FRAP Fe2+/L) (μmolFe2+/g DPPH (g/ml) XO nguyên liệu (g/ml) khô) Cao C 907±18 28,47±0,56 > 25 > 100 Cao Et 4033±80 383,19±7,58 6,61±0,17 67,65±0,38 Cao AQ 3253±46 504,86±7,10 10,12±0,13 79,84±0,22 Acid ascorbic 11267±62 2,89±0,09 Allopurinol 5,79±0,16 27 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Phương pháp FRAP sử dụng để phân tích chất chống oxy hóa Kết hoạt tính chống oxy hóa mẫu trình bày bảng Giá trị chống oxy hóa mẫu (μmolFe2+/g ngun liệu khơ) xếp theo thứ tự tăng dần cao C < cao Et < cao AQ Cao chiết thơ Et có hoạt tính chống oxy hóa tiềm với hoạt tính chống oxy hóa 2,79 lần so với acid ascorbic tinh khiết nồng độ mẫu ban đầu mg/ml Hoạt tính quét gốc tự DPPH Phương pháp DPPH phương pháp thường sử dụng để đo hoạt tính chất chống oxy hóa đơn giản, nhanh chóng ổn định Kết trình bày bảng cho thấy mẫu cao Et có hoạt tính quét gốc tự DPPH cao so với hai cao chiết cịn lại Hoạt tính qt gốc tự cao Et với giá trị IC50 = 6,61 g/ml 2,28 lần so với acid ascorbic tinh khiết Hoạt tính ức chế enzyme xanthin oxidase Xanthin oxidase loại enzym xúc tác cho phản ứng oxy hóa hypoxanthine thành xanthine sau tiếp tục xúc tác cho phản ứng oxy hóa xanthine thành acid uric Khi acid uric thể người bị tích tụ nhiều dẫn đến bệnh gút Allopurinol loại thuốc đặc trị gút có tác dụng ức chế enzyme xanthin oxidase có tác dụng phụ nên việc tìm kiếm, thay loại Kỷ yếu khoa học thuốc có nguồn gốc từ thực vật an tồn điều cần thiết Kết quả, nồng độ 100 g/ml, cao C, Et AQ có hoạt tính ức chế xanthin oxidase 10,72%, 77,87% 60,86% Giá trị IC50 cao chiết phương pháp trình bày bảng Như Cao Et có tiềm chống oxy hóa, ức chế enzyme xanthin oxidase Hoạt tính chống tăng đường huyết nhân trần tía Hình cho thấy thay đổi nồng độ đường huyết nhóm chứng trắng (nhóm 1) mức ổn định nhóm tăng đường huyết (nhóm 2) nằm mức cao Kết cho thấy nhóm động vật cho uống cao chiết Et AQ từ nhân trần tía có khả giảm nồng độ glucose đáng kể liều 40 mg/kg cao Et liều 50 mg/kg cao AQ tương đương với nhóm chứng trắng nhóm thuốc glibenclamide liều 10 mg/kg (p>0,05) Điều chứng tỏ cao chiết từ nhân trần tía có tiềm việc phịng ngừa hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường cho người liều dùng thấp thể hoạt tính giúp ổn định đường huyết Đây báo cáo hoạt tính chống tăng đường huyết từ nhân trần tía báo cáo Cao chiết từ nhân trần tía nghiên cứu tiếp tục mơ hình động vật bị đái tháo đường type type Hình Hiệu chống tăng đường huyết cao Et AQ 28 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học nhiên có Nhân trần tía mà chưa có tài liệu công bố Ứng dụng Đã đề xuất quy trình sản xuất trà túi lọc chưa có thị trường đánh giá hoạt tính dịch chiết trà mơ hình động vật tăng đường huyết cấp tính tốt Hoạt tính chống tăng đường huyết mơ hình in vivo chuột bị gây tiểu đường streptozocin Streptozotocin dẫn xuất n-nitroso glucosamine Streptozocin coi tác nhân phá hủy tế bào beta tuyến tụy nghiên cứu đái tháo đường, STZ làm cản trở trinh oxy hóa chuyển hóa tế bào, gây độc cho tế bào beta Chức tế bào beta đảo tụy bị suy giảm, gây giảm lượng insulin tiết vào máu, dẫn tới lượng đường huyết cao máu Phân lập hợp chất tự nhiên Cao chiết cồn sau cho chạy qua nhiều sắc ký cột khác chạy sắc ký lớp mỏng thu tinh thể AB3 Sau định danh phương pháp phổ khối cộng hưởng từ hạt nhân xác định isoscuerllarein 8-O-βD-glucopyranoside hợp chất tự KẾT LUẬN Những kết thu nghiên cứu chứng minh cao ethanol cao nước Nhân trần tía nguồn chất chống oxy hóa tự nhiên nên có khả phòng ngừa, ngăn chặn nhiều loại bệnh liên quan đến stress oxy hóa, đồng thời tác nhân ngăn ngừa bệnh gút bảo vệ gan Đồng thời phân lập hợp chất tự nhiên tinh khiết từ cao chiết cồn Nhân trần tía sản xuất sản phẩm trà có khả làm giảm đường huyết TÀI LIỆU THAM KHẢO BENZIE I F., STRAIN J J (1996) The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of “antioxidant power”: the FRAP assay Analytical Biochemistry 239(1): 70-76 CAN BASER K.H (2008) Biological and pharmacological activities of carvacrol and carvacrol bearing essential oils Current pharmaceutical design, 14(29): 3106-3119 ĐỖ TẤT LỢI (2004) Những thuốc vị thuốc Việt Nam Nhà xuất Y học, Hà Nội, 625-629 GONZALEZ-BURGOS E., GOMEZ-SERRANILLOS, M P (2012) Terpenoid compounds in nature: A review of their potential antioxidant activity Current medicinal chemistry, 19: 5319-5341 HOSTETTMANN K (1991) Methods in plant biochemistry assay for bioactivity, Academic Press Harcourd Brace Jovanovic Pud.6: tr.142-147 29 ... trình nghiên cứu nhân trần tía Mục đích nghiên cứu nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa in vitro, in vivo tác dụng chống tăng đường huyết nhân trần tía TỒNG QUAN Bệnh tiểu đường xem bệnh mãn tính. .. Gộp phân đoạn có học thực vật nhân trần tía cho thấy thành phần giống nhau, áp suất ngun liệu có nhóm hoạt chất để thu dịch đậm đặc polyphenol, flavonoid, triterpenoid, Các chất phân lập từ phân. .. từ nhân trần tía có tiềm việc phòng ngừa hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường cho người liều dùng thấp thể hoạt tính giúp ổn định đường huyết Đây báo cáo hoạt tính chống tăng đường huyết từ nhân trần