Nghiên cứu hoạt tính sinh học định hướng phân lập hợp chất tinh khiết từ cây nhân trần tía (adenosma bracteosum bonati)

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài “Nghiên cứu hoạt tính sinh học định hướng phân lập hợp chất tinh khiết từ nhân trần tía (Adenosma bracteosum Bonati)” cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu tài liệu đồ án trung thực chưa công bố công trình nghiên cứu Tất tham khảo kế thừa trích dẫn tham chiếu đầy đủ Tôi xin chịu trách nhiệm với lời cam đoan Sinh viên thực Lương Thị Ngọc Hân LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp này, lời xin cảm ơn chân thành đến tồn thể thầy trường Đại học Cơng nghệ thành phố Hồ Chí Minh nói chung thầy viện Khoa học Ứng dụng HUTECH nói riêng, người tận tình hướng dẫn, dạy dỗ trang bị cho tơi kiến thức bổ ích năm năm vừa qua Đặc biệt xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô TS Nguyễn Ngọc Hồng, người tận tình hướng dẫn, trực tiếp bảo tạo điều kiện giúp đỡ tôi, với anh chị học viên cao học bạn sinh viên làm việc, học tập Phòng thí nghiệm viện Khoa học Ứng dụng HUTECH - Trường Đại học Cơng nghệ TP HCM Phòng Hố hợp chất thiên nhiên, Viện Cơng nghệ Hố học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam nhiệt tình giúp đỡ, động viên tơi suốt trình làm đồ án tốt nghiệp Sau xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè động viên, cổ vũ đóng góp ý kiến q trình học tập, nghiên cứu q trình làm đồ án tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn! Hồ Chí Minh, ngày 03 tháng năm 2018 Lương Thị Ngọc Hân ii MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH .vii LỜI MỞ ĐẦU Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan chi Adenosma 1.2 Tổng quan nhân trần tía ( Adenosma bracteosum Bonati) 1.2.1 Đặc điểm hình thái 1.2.2 Đặc điểm phân bố 1.2.3 Một số thành phần hóa học nghiên cứu 1.2.4 Hoạt tính sinh học 13 1.3 Định nghĩa gốc tự do, stress oxy hóa, chất chống oxy hóa bệnh tiểu đường 16 1.3.1 Khái niệm gốc tự stress oxy hóa 16 1.3.2 Tác hại stress oxy hóa 17 1.3.3 Chất chống oxy hóa 19 1.3.4 Bệnh tiểu đường 20 1.4 Hợp chất tự nhiên từ thực vật 21 1.4.1 Terpenoid 21 1.4.2 Steroid 23 1.4.3 Polyphenol 25 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Ngun liệu, dung mơi, hố chất, trang thiết bị 28 2.1.1 Nguyên liệu 28 2.1.2 Dung mơi, hố chất 28 2.1.3 Trang thiết bị 29 2.2 Phương pháp nghiên cứu 30 i 2.2.1 Xác định độ ẩm 31 2.2.2 Quá trình chiết thu nhận cao chiết 31 2.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng cao thu 32 2.2.4 Phương pháp định tính thành phần hóa học từ cao cồn nước Nhân trần tía 33 2.2.5 Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa mơ hình DPPH 35 2.2.6 Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa mơ hình FRAP 36 2.2.7 Phương pháp ức chế enzym xanthin oxidase 37 2.2.8 Phương pháp đánh giá khả chống tăng đường huyết mô hình in vivo chuột tăng đường huyết cấp tính 37 2.2.9 Phương pháp chống oxy hóa in vivo qua mô hình khả bảo vệ gan mẫu nghiên cứu mô hình chuột bị gây độc bởi CCl4 40 2.2.10 Phân lập xác định cấu trúc 42 2.2.11 Xác định độ tinh khiết sắc ký lớp mỏng 43 2.2.12 Phương pháp xử lý số liệu 43 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 3.1 Thử độ ẩm dược liệu 44 3.2 Khảo sát hàm lượng cao chiết 44 3.3 Định tính thành phần hóa học nhân trần tía 45 3.4 Kết khả kháng oxy hóa mơ hình DPPH 52 3.5 Kết khả kháng oxy hóa mơ hình FRAP 53 3.6 Khả ức chế enzyme xanthin oxidase 55 3.7 Ảnh hưởng dịch chiết nhân trần tía lên lượng đường máu 56 3.8 Kết khảo sát khả chống oxy hóa in vivo qua mơ hình khả bảo vệ gan mẫu nghiên cứu mô hình chuột bị gây độc CCl4 58 3.9 Phân lập xác định cấu trúc 59 3.9.1 Phân lập sắc ký cột 59 3.9.2 Khảo sát cấu trúc độ tinh khiết chất phân lập 67 3.10 Khảo sát ảnh hưởng AB3 lên lượng đường máu 71 ii KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 72 KẾT LUẬN 72 KIẾN NGHỊ 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO 74 Tài liệu nước 74 Tài liệu nước 75 PHỤ LỤC 80 iii 13 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT C-NMR: C- Nuclear Magnetic Resonance 13 H-NMR: 1H-Nuclear Magnetic Resonance Ac: Acetone AG: Acid Gallic ALT: enzyme alanin aminotrasferase AQ: aqueous (nước) C, CH, CHCl3: chloroform CCl4: carbon tetrachloride db: gam dược liệu khô DMSO: Dimethyl sulfoxyde DPPH: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl EA: Ethyl acetate EI: Electron Impact Mass Spectroscopy Et: ethanol (cồn) FRAP: Ferric ion Reducing Antioxydant Power H: Hexan HCTN: hợp chất tự nhiên IC50: half maximal inhibitory concentration Me, MeOH: Methanol MS: Mass spectroscopy NMR: Nuclear Magnetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân) RNS: Reactive Nitrogen Species ROS: Reactive Oxygen Species SKLM: Sắc ký lớp mỏng SRB: Sulforhodamine B TFC: Total Flavonoids Content (Hàm lượng flavonoid tổng số) iv TPC: Total Polyphenols Content (Hàm lượng polyphenol tổng số) TPHH: thành phần hóa học TPTZ: 2,4,6-tripyridyl-s-triazin W: nước XO: Xathin oxidase v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các thành phần hóa học có tinh dầu Adenosma bracteosum Bonati 11 Bảng 1.2 Các ROS RNS thể sinh học 16 Bảng 1.3 Các bệnh liên quan đến oxy hóa DNA 18 Bảng 1.4 Các bệnh liên quan đến oxy hóa protein 19 Bảng 1.5 Các bệnh liên quan đến oxy hóa lipid 19 Bảng 3.1 Độ ẩm dược liệu 44 Bảng 3.2 Khảo sát hàm lượng cao chiết theo dung môi 44 Bảng 3.3 Kết phân tích sơ thành phần hóa học 45 Bảng 3.4 Hình ảnh định tính thành phần hóa học 46 Bảng 3.5 Các hệ dung môi sử dụng cho sắc ký cột cao phân đoạn C 60 Bảng 3.6 Kết phân đoạn từ sắc ký cột cao phân đoạn C 62 Bảng 3.7 Kết sắc ký cột silica gel phân đoạn A3 64 Bảng 3.8 Kết sắc ký cột silica gel phân đoạn B4 66 Bảng 3.9 Kết đo đường huyết nhóm chuột uống AB3 so với nhóm chuột đối chứng 71 vi DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH Sơ đồ 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 30 Sơ đồ 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm thử hoạt tính mẫu chuột tăng đường huyết cấp tính 38 Sơ đồ 2.3 Khả bảo vệ gan mơ hình chuột bị gây độc bởi CCl4 41 Hình 1.1 Cây Nhân trần tía (Adenosma bracteosum Bonati) Hình 2.1 Chuột cho uống dung dịch glucose 2g.kg-1 thể trọng 39 Hình 2.2 Bảng tra nồng độ đường huyết 40 Hình 3.1 Biểu đồ so sánh giá trị IC50 cao chiết thí nghiệm quét gốc tự DPPH 53 Hình 3.2 Biểu đồ kết tác dụng chống oxy hóa mẫu thử nồng độ 1mg/ml thí nghiệm FRAP 54 Hình 3.3 Biểu đồ kết hoạt tính ức chế enzyme xathin oxidase 55 Hình 3.4 Hiệu chống tăng đường huyết cao Et AQ 56 Hình 3.5 Hiệu chống oxy hóa in vivo cao Et AQ 58 Hình 3.6 Phân đoạn C soi UV 254nm sau nhúng TTVS màu 59 Hình 3.7 Mẫu nạp vào chạy sắc ký cột 61 Hình 3.8 Phân đoạn A3 soi UV 265nm sau nhúng TTVS màu 63 Hình 3.9 Phân đoạn A3 nạp vào cột 64 Hình 3.10 Phân đoạn B4 soi UV 254nm sau nhúng TTVS màu 65 Hình 3.11 Sắc ký cột phân đoạn B4 66 Hình 3.12 Phân đoạn E1 E2 sau nhúng TTVS màu 67 Hình 3.13 AB3 kết tinh hình kim, màu vàng 68 Hình 3.14 AB3 UV 254nm sau nhúng TTVS màu 69 vii Hình 3.15 Phổ EI-MS AB3 69 Hình 3.16 Cấu trúc hợp chất AB3 70 viii [9] Nguyễn Diệu Liên Hoa, Phạm Đình Hùng (2015) Hóa học hợp chất tự nhiên, Nhà xuất Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh [10] Nguyễn Đức Hạnh, Nguyễn Minh Đức, Nguyễn Minh Cang (2008) Nghiên cứu hợp chất polyphenol từ Nhân trần tía (Adenosma bracteosum Bonati Scrophulariaceae), Tạp chí Dược liệu, 13(1), 5-12 [11] Hồng Tuấn (2000) Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hoá Nhân trần Adenosma caeruleum số dược liệu khác, Luận văn tốt nghiệp Dược sỹ Đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội [12] Nguyễn Kim Phi Phụng (2007) Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Nhà xuất Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh [13] Nguyễn Minh Đức, Nguyễn Hà Thanh Trúc, Võ Duy Huân (1999), “Nghiên cứu cấu trúc hóa học hợp chất có tác dụng sinh học từ Nhân trần tía”, Hội nghị khoa học cơng nghệ Dược trước thềm kỷ 21, Khoa Dược, tr 23 [14] Phạm Hoàng Hộ (1999) Cây cỏ Việt Nam, Tập Nhà xuất Trẻ, Tp.HCM, 902904 [15] Trần Hùng (2004) Phương pháp nghiên cứu dược liệu Đại học Y Dược TP.HCM [16] Vũ Mạnh Hùng, Bùi Thị Bích Vân (2008) Tác dụng bảo vệ protecliv thực nghiệm, Tạp chí Dược liệu, 13(1), 40-44 Tài liệu nước [17] Abreu, M B., Malafronte, N., Van Kiem, P., Braca, A (2009) A new iridoid from Adenosma caeruleum R Br Fitoterapia, 80(6), 358-360 75 [18] Adam, G., Porzel, A., Sung, T V., Schmidt, J (1992) A monoterpenoid peroxyde from Adenosma caeruleum Phytochemistry, 31(8), 2885-2887 [19] Adibhatla, R.M., Hatcher, J.F (2010) Lipid oxidation and peroxidation in CNS health and disease: From molecular mechanisms to therapeutic opportunities, Antioxidants Redox Signaling, 12(1), 125 – 169 [20] Awad, A B., Fink C S (2000) Phytosterols as anticancer dietary components: evidence and mechanism of action, The Journal of nutrition,130(9), 2127-2130 [21] Benzie, I F., & Strain, J J (1996) The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of “antioxidant power”: the FRAP assay Analytical biochemistry, 239(1), 70-76 [22] Can Baser, K H (2008) Biological and pharmacological activities of carvacrol and carvacrol bearing essential oils Current pharmaceutical , 14(29), 3106-3119 [23] Cooke, M.S., Evans, M.D., Dizdaroglu, M., Lunec, J (2003) Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease, The FASEB Journal, 17, 1195 – 1214 [24] De Stefani E, Boffetta P, Ronco AL, Brennan P, Deneo-Pellegrini H, Carzoglio JC et al (2000) Plant sterols and risk of stomach cancer: A case-control study in Uruguay Nutr Cancer 37, 140–144 [25] Denisov, E.T., Afanas’ev, I.B (2005) Oxidation and Antioxidants in Organic Chemistry and Biology, Taylor Francis Group, United State of America [26] Dix, T.A., Hess, K.M., Medina, M.A., Sullivan, R.W., Tilly, S.L., Webb, T.L (1996) Mechanism of site-selective DNA nicking by the hydrodioxyl (perhydroxyl) radical, Biochemistry, 35, 4578 – 4583 76 [27]., T., Kuete, V (2010) Cameroonian medicinal plants pharmacology and derived natural products Frontiers in pharmacology, 1, 123 [28] Fulda, S (2009) Betulinic acid: a natural product with anticancer activity Molecular nutrition food research, 53(1), 140-146 [29] Gonzalez-Burgos, E., Gomez-Serranillos, M P (2012) Terpenoid compounds in nature: A review of their potential antioxidant activity Current medicinal chemistry, 19(31), 5319-5341 [30] Hostettmann K (1991) Methods in plant biochemistry assay for bioactivity, Academic Press Harcourd Brace Jovanovic Pud.6: tr.142-147 [31] Jovanovic S V and Simic M G (2000) Antioxidants in nutrition, Annals of the New York Academy of Sciences, 899, 326-334 [32] Mendilaharsu M, Stefani ED, Deneo-Pellegrini H, Carzoglio J, Ronco A (1998) Phytosterols and risk of lung cancer: A case-control study in Uruguay Lung Cancer 21, 37–45 [33] Nyunai, N., Njikam, N., Addennebi, E.H., Mbaford, J.T., and Lamnaouer, D (2004) Hypoglycaemic and antihyperglycaemic activity of Ageratum conyzoides L in rats African Journal of Traditional Complementary and Alternative Medicines, (6) 123-130 [34] Oadir MI, Malik SA (2008) Plasma lipid profile in gynecologic cancers Eur J Gynaecol Oncol 29, 158–161 [35] Omotayo O Erejuwa (2012) Oxidative Stress in Diabetes Mellitus: Is There a Role for Anti-hyperglycemic Drugs and/or Antioxidants? Oxidative Stress and Diseases, InTech publisher 77 [36] Pham-Huy, L A., He, H., Pham-Huy, C (2008) Free radicals, antioxidants in disease and health Int J Biomed Sci, 4(2), 89-96 [37] Puri, D (2014) Textbook of medical biochemistry Elsevier Health Sciences [38] Rahman, M., Hasan, N., Das, A K., Hossain, T., Jahan, R., Khatun, A.Rahmatullah, M (2011) Effect Of Delonix Regia Leaf Extract On Glucose Tolerance In Glucoseinduced Hyperglycemic Mice African Journal of Traditional, Complementary and Alternative Medicines, 8(1) [39] Safe, S.H., L Prather, P., K Brents, L., Chadalapaka, G., Jutooru, I (2012) Unifying mechanisms of action of the anticancer activities of triterpenoids and synthetic analogs Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry (Formerly Current Medicinal Chemistry-Anti-Cancer Agents), 12(10), 1211-1220 [40] Shacter, E (2000) Quantification and significance of protein oxidation in biological samples, Drug Metabolism Reviews, 32(34), 307 – 326 [41] Singh N and Rajini P S (2004) Free radical scavenging activity of an aqueous extract of potato peel Food chemistry, 85, 611-616 [42] Trombetta, D., Castelli, F., Sarpietro, M G., Venuti, V., Cristani, M., Daniele, C., Bisignano, G (2005) Mechanisms of antibacterial action of three monoterpenoids Antimicrobial agents and chemotherapy, 49(6), 2474-2478 [43] Tsankova, E T., Kuleva, L V., Thanh, L T (1994) Composition of the Essential Oil of Adenosma bracteosum Bonati Journal of Essential Oil Research, 6(3), 305-306 78 [44] Umamaheswari M., AsokKumar K., Somasundaram A., Sivashanmugam T (2007) Xanthine oxidase inhibitory activity of some Indian medical plants”, Journal of Ethnopharmacology, 109(3): 547-551 [45] Von Gadow A., Joubert E and Hansmann C F., (1997) Comparison of antioxidant activity of aspalanthin with that of orther plant phenols of Rooibos tea (Aspalathus linearis), α-tocopherol, BHT, and BHA, Journal of Agricultural and Food Chemistry 45 632-638 [46] Wallace, K B (Ed.) (1997) Free radical toxicology CRC Press [47] Woyengo, T A., Ramprasath, V R., Jones, P J H (2009) Anticancer effects of phytosterols, European Journal of Clinical Nutrition, 63(7), 813-820 [48] Yadav RN, Agrawala M (2011) Phytochemical analysis of some medicinal plants, J Physiol; 3(12):10–14 [49] Yen G C and Duh P D (1994) Scavenging effect of methanolic extracts of peanut hulls on free radical and active oxygen species, Agricultural and Food Chemistry 42 (3) 629-632 [50] Yoshida, Y., Niki, E (2003) Antioxidant effects of phytosterol and its components Journal of nutritional science and vitaminology, 49(4), 277-280 [51] http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.4830171.html?rid=52a31ea8- 1021-4149-b239-8158dee56b0c 79 PHỤ LỤC Phụ lục A – Phổ MS AB3 80 Phụ lục B – Phổ 1H-NMR chất AB3 81 Phụ lục C - Phổ 13C-NMR chất AB3 82 Phụ lục D – Phổ HSQC AB3 83 Phụ lục E – Phổ HMBC AB3 84 Phụ lục F – Sự tương quan nhóm thử AB3 nhóm chứng trắng 85 Phụ lục G - Sự tương quan nhóm thử AB3 nhóm chứng dương 86 ... Các nghiên cứu trước A Bracteosum chủ yếu tác dụng dược lý, chưa có nhiều nghiên cứu thành phần hố học Do đề tài Nghiên cứu hoạt tính sinh học định hướng phân lập hợp chất tinh khiết từ Nhân trần. .. học tủa dịch chiết cồn Nhân trần tía, từ định hướng chiết xuất phân lập nhóm hợp chất hố học cụ thể góp phần khẳng định thành phần hoá học Nhân trần tía Phân lập xác định cấu trúc chất phân lập. .. trần tía (Adenosma bracteosum Bonati) thực với mục tiêu cụ thể:  Phân tích sơ thành phần hoá học từ tủa dịch chiết cồn Nhân trần tía  Chiết xuất phân lập hợp chất hoá học từ tủa cao cồn Nhân trần