TRNG DI HC m TP HCM CNG HOA XA HI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh Phúc KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHIẾU ĐĂNG KÝ TÊN CHUYÊN ĐỀ THỰC TẬP TỐT NGHIỆP Họ tên SV : LÊ ANH TUẤN Mã số SV : 1053010888 Email : leanhtuan130692@gmail.com Điện thoại : 01656635759 Họ & tên GVHD : Nguyễn Văn Minh Học hàm – Học vị : Thạc sỹ Đơn vị công tác: Khoa Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Mở Tp HCM Địa liên lạc :Khoa Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Mở Tp HCM Số điện thoại : 0909192195 Tên chuyên đề: Đánh giá khả đối kháng Vibrio parahaemolyticus số chủng Bacillus sàng lọc yếu tố ảnh hưởng đến sinh khối chủng có hoạt tính mạnh Giảng viên hướng dẫn Sinh viên (ký ghi rõ họ tên) (ký ghi rõ họ tên) Ý kiến tổ chuyên ngành : Tên chuyên đề: Đề cương nghiên cứu: Thời gian tiến hành: Kết luận: Đạt Không đạt Xem xét lại Trang TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC Độc lập – Tự – Hạnh phúc ĐỀ CƯƠNG CHUYÊN ĐỀ THỰC TẬP TỐT NGHIỆP Tên chuyên đề: Đánh giá khả đối kháng Vibrio parahaemolyticus số chủng Bacillus sàng lọc yếu tố ảnh hưởng đến sinh khối chủng có hoạt tính mạnh Chun ngành : Vi Sinh – Sinh Học Phân Tử Họ tên sinh viên : LÊ ANH TUẤN MSSV : 1053010888 Giảng viên hướng dẫn : Nguyễn Văn Minh Học hàm - học vị : Thạc sĩ Đơn vị công tác : Khoa Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Mở Tp HCM Thời gian thực : từ 29/10/2013 – 23/2/2014 Địa điểm thực : Phịng thí nghiệm Cơng Nghệ Vi Sinh, Trường Đại học Mở Tp HCM Đặt vấn đề : Nước ta nước có lợi để phát triển ngành nuôi trồng thủy sản Theo Tổng Cục Thủy Sản Việt Nam: ước tính giá trị nuôi trồng thủy sản tháng đầu năm 2013 đạt 45.185 tỷ đồng (trong tổng số 83.318 tỷ đồng giá trị sản xuất thủy sản) Sản lượng ước đạt 1.405 nghìn (tăng 2,6% so với kỳ năm 2012) Do phải đối mặt với nhiều khó khăn khách quan chủ quan nên kết sản lượng nuôi trồng đạt 40,5% kế hoạch năm; Trong đó, sản lượng tơm sú đạt 80 nghìn (bằng 25,8% kế hoạch năm, giảm 27,1% so với kỳ năm trước), tơm thẻ chân trắng đạt 20 nghìn (bằng 9,5% kế hoạch năm, tăng 33,3% so với kỳ năm trước) cá tra đạt 461 nghìn (bằng 35,8% kế hoạch năm, giảm 16,9% so với kỳ năm trước) Trang Tuy nhiên, tình trạng dịch bệnh tơm hồnh hành nhiều vùng ni tôm nước ta đặc biệt hội chứng tôm chết sớm Early Mortality Syndrome (EMS) hay gọi hội chứng hoại tử gan tụy Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome (AHPNS) [3], [6] Ở Việt Nam, bệnh xuất từ năm 2010, tàn phá rộng rãi EMS báo cáo kể từ tháng năm 2011 đồng sông Cửu Long (Việt Nam) Nó ảnh hưởng đến khu vực sản xuất tơm: Tiền Giang, Bến Tre, Kiên Giang, Sóc Trăng, Bạc Liêu Cà Mau với tổng diện tích ao tôm khoảng 98.000 Trong tháng năm 2011, thiệt hại chưa thấy tôm sú báo cáo 11.000 nuôi tôm Bạc Liêu, 6.200 Trà Vinh (tổng cộng 330 triệu tôm chết gây thiệt hại 12 tỷ đồng), 20.000 Sóc Trăng (gây thiệt hại 1,5 nghìn tỷ) [13] Trong năm 2010, hội chứng tử vong sớm (EMS), bệnh tôm, xuất trang trại nuôi tôm miền nam Trung Quốc đảo Hải Nam Trung Quốc AHPNS xác nhận Việt Nam Malaysia năm 2011 [11], [12] Bệnh EMS đến Thái Lan năm 2012 [5], [6] Bệnh xuất vòng 20-30 ngày sau thả giống, tôm sú tôm thẻ chân trắng Tôm bị bệnh trở nên lờ đờ, ngừng ăn, dày ruột trống rỗng, vỏ mỏng, màu sắc nhợt nhạt, tăng trưởng chậm, gan tụy xanh xao, nhủng teo tỉ lệ chết lên tới 100% làm cho ao nuôi tôm bị ảnh hưởng nghiêm trọng [12] Vào đầu năm 2013, Phịng thí nghiệm bệnh học ni trồng thủy sản Đại học Arizona cô lập tác nhân gây bệnh EMS/AHPNS môi trường nhân tạo Thử nghiệm lấy từ mẫu thực địa cho thấy nguyên nhân gây bệnh vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus [7] Hội chứng tử vong sớm (EMS), hay gọi hội chứng hoại tử gan tụy (AHPNS), công bố nhà khoa học, nguyên nhân gây tử vong cao trang trại tôm Việt Nam EMS/AHPNS gây loại vi khuẩn (Vibrio parahaemolyticus) bị nhiễm phage (một thể thực khuẩn) làm cho độc tố vi khuẩn tăng lên Chúng xâm chiếm đường tiêu hóa tơm sinh độc tố gây phá hủy mô rối loạn chức gan tụy, quan tiêu hóa tôm (theo FAO) [3], [5], [7], [11], [13] Vấn đề đặt kiểm sốt Vibrio parahaemolyticus phage khơng có vật chủ để tồn khơng có Vibrio parahaemolyticus gây độc tơm Thêm vào đó, kháng sinh bị hạn chế sử dụng nuôi trồng thủy sản Việc điều trị kháng sinh hóa chất, đặc biệt dùng nhiều hóa chất tiêu diệt phần lớn vi khuẩn có lợi nước ao tơm, khơng vi khuẩn gây bệnh Bên cạnh đó, dư lượng kháng sinh hóa chất cịn gây ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm sức khỏe người sử dụng Ngược lại với Trang trên, chế phẩm sinh học giúp cho sản phẩm từ thủy sản an tồn khơng gây ảnh hưởng đến sức khỏe người [10], [16] Trong nuôi trồng thủy sản đặc biệt tôm, vi khuẩn thường ứng dụng làm chế phẩm sinh học phần lớn thuộc chi Bacillus Trong thủy sản, Bacillus spp có khả tạo enzyme ngoại bào hỗ trợ tiêu hóa, sinh kháng sinh hay chất ức chế có đặc tính đối kháng với chủng vi sinh vật gây bệnh mà ghi nhận nhiều khả đối kháng với Vibrio spp [2], [15] Nhóm nghiên cứu có thành cơng in vitro khả kiểm soát Vibrio spp vi khuẩn Bacillus Các kết cơng bố tạp chí Nơng nghiệp phát triển nơng thơn tạp chí Khoa học trường Đại học Mở TP.Hồ Chí Minh Xuất phát từ tình hình chúng tơi xin tiến hành thực đề tài “Đánh giá khả đối kháng Vibrio parahaemolyticus số chủng Bacillus sàng lọc yếu tố ảnh hưởng đến sinh khối chủng có hoạt tính mạnh” Mục tiêu : - Sàng lọc khả đối kháng số chủng Bacillus spp với Vibrio parahaemolyticus - Sàng lọc yếu tố ảnh hưởng đến sinh khối chủng Bacillus có hoạt tính mạnh Nội dung kế hoạch thực đề tài : Nội dung thực  Nội dung tìm hiểu Thời gian Dự kiến kết tuần (29/10/2013  Hiểu cách thực – 5/11/2013) hiện, phương pháp sàng lọc tính đối kháng yếu tố ảnh hưởng đến sinh khối Bacillus  Tổng hợp tài liệu tuần (6/11/2013 –  Tổng hợp tất tài 13/11/2013) liệu Trang  Hoạt hóa chủng giống tuần (14/11/2013  Tăng sinh chủng Bacillus – 21/11/2013) giống để chuẩn bị thí nghiệm  Thử tính đối kháng tuần (22/11/2013  Sàng lọc chủng chủng Bacillus với Vibrio – 6/12/2013) có tính đối kháng mạnh parahaemolyticus  Xây dựng đường cong tăng tuần (7/12/2013 –  Xác định đường cong trưởng chủng Bacillus vừa 21/12/2013) tăng trưởng chủng sàng lọc Bacillus  Xác định yếu tố ảnh hưởng tuần (21/12/2013  Xác định yếu tố đến sinh khối Bacillus – 18/1/2013) môi trường cần thiết  Viết hoàn thiện tuần (18/1/2013 –  Bài báo cáo 17/1/2013) Phương pháp nghiên cứu chính:  Hoạt hố giống: cách cấy sinh khối Bacillus spp từ ống thạch nghiêng vào ống nghiệm chứa ml môi trường NB Ủ 37 oC/ 18 giờ, tốc độ lắc 250 vòng/phút [15]  Phương pháp đục lỗ thạch: Các chủng Vibrio spp sau phân lập đưa vào môi trường nuôi cấy tăng sinh (canh NB, 37oC ) Sau thêm 25 l môi trường nuôi cấy Vibrio spp điều chỉnh tới mật độ tế bào 10 CFU/ml, vào bình chứa 25ml dung dịch NA có bổ sung 1,5% NaCl 45 oC, đổ vào đĩa petri (đường kính 9cm) Dùng dụng cụ đục lỗ thạch tạo giếng (đường kính 8mm), bơm 50 l dịch nuôi cấy vi khuẩn Bacillus spp (điều chỉnh mật độ tế bào đến 5.108 CFU/ml Trang 0,85 % NaCl) vào giếng ủ 37oC 24 Đo đường kính vịng ức chế vi khuẩn [15]  Thử đối kháng phương pháp vạch vng góc: Chủng vi khuẩn thử nghiệm tăng sinh môi trường NB, vi khuẩn gây bệnh tăng sinh môi trường pepton kiềm 30oC/ 24 Vi khuẩn gây bệnh cấy thẳng vạch thứ môi trường NA bổ sung 1,5% NaCl Sau lấy vi khuẩn thử nghiệm vạch thẳng vng góc với vạch thứ nhất, ủ 30oC Thử nghiệm tiến hành lần, quan sát sau 24 giờ, 48 giờ, 72 [14]  Xây dựng đường cong tăng trưởng phương pháp đo mật độ quang bước sóng 600 nm Sau ni cấy liên tục 24 [9]  Xây dựng đường tương quan OD600 mật độ tế bào tương ứng  Thực pha loãng huyền phù tế bào chủng Bacillus cho thu huyền phù có OD600 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,0  Định lượng tế bào giá trị OD phương pháp đếm khuẩn lạc:[4]  Pha loãng huyền phù tế bào thành nồng độ pha loãng 10-1, 10 -2, 10- , 10 -4, …  Hút 0,1 ml huyền phù nồng độ pha loãng cấy trang môi trường NA (24 – 48 giờ/37oC), nồng độ lặp lại lần  Nhận diện khuẩn lạc đếm số khuẩn lạc nồng độ: Chọn nồng độ có số khuẩn lạc mọc khoảng đếm thích hợp (25 – 250 khuẩn lạc/ đĩa), đếm số lượng tế bào đĩa nồng độ pha lỗng  Tính lượng tế bào Bacillus 1ml mẫu theo cơng thức: Trong đó: A: mật độ tế bào (CFU/ mL) N: tổng số khuẩn lạc đếm ni: số đĩa đếm nồng độ pha loãng i V: số mL dịch mẫu cấy vào đĩa fi: nồng độ pha lỗng có số khuẩn lạc chọn đếm Trang  Theo dõi khảo sát tăng trưởng vi sinh vật mốc thời gian cách sử dụng đường tương quan mật độ tế bào OD600 để suy mật độ tế bào thời điểm khảo sát  Xác định yếu tố mức ảnh hưởng đến sinh khối Bacillus thí nghiệm thay đổi yếu tố Các yếu tố chọn là: glucose, peptone, (NH4)2SO4, K2HPO4, KH2PO4, MgSO4.7H2O, MnCl2, CaCl2, FeSO4.7H2O, NaCl, pH, nhiệt độ [9], [15] Tài liệu tham khảo (nếu có) :  Tài liệu tiếng việt: [1] Huỳnh Thị Thanh Hiền, Trịnh Thị Bích Huyền, Bùi Hồng Quân, (2010), Sử dụng ma trận PLACKETT-BURMAN phương pháp đáp ứng bề mặt thiết kế cấu trúc có tâm nhằm tối ưu hóa sinh tổng hợp Lipase từ Bacillus licheniformis GBDTY1, Tạp chí Công nghệ Sinh học 8(3A), pp 811-818 [2] Nguyễn Văn Minh, Dương Nhật Linh, Đỗ Bảo Ngọc, Trần Thị Khánh Linh, Hà Thị Bảo Yến, Nguyễn Văn Hòa, Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh, Khả ức chế Vibrio spp gây bệnh số chủng Bacillus spp, phân lập từ trùn quế [3] Dang Thi Hoang Oanh (email dthoanh@ctu.edu.vn , Department of Aquatic Pathology, College of Aquaculture and Fisheries, Cantho University, Vietnam), Tran Viet Tien, Truong Quoc Phu and Nguyen Thanh Phuong, February 2013, Hepatopancreatic Necrosis Syndrome (AHPNS) on Farmed Shrimp in The Mekong Delta, Vietnam [4] Trần Linh Thước, Đặng Thị Phương Thảo, Đỗ anh Tuấn, Cao Thị Ngọc Phượng, Võ Cẩm Quy, (2011), Thực tập vi sinh vật, Nhà xuất Đại học Quốc gia Hồ Chí Minh  Tài liệu tiếng anh: [5] Eduardo M L and Mohan C.V (2012), Early Mortality Syndrome (EMS)/Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome (AHPNS): An emerging threat in the Asian shrimp industry, fish health section asian fisherier society, pp 1-7 [6] Flegel, T.W (2012), Historic emergence, impact and current status of shrimp pathogens in Asia Journal of Invertebrate Pathology 110, pp 166-173 [7] Redman R.M., Pantoja C.R.,Noble B.L and Loc Tran (January/February 2012), (Department of Veterinary Science and Microbiology, University of Arizona) Volume 15, Issue 1, Page 40 Trang [8] Rengpipat S ,Phianphak W ,Piyatiratitivorakul S ,Menasveta P.(1998) Effects of a probiotic bacterium on black tiger shrimp Penaeus monodon survival and growth, Aquaculture167, pp 301–313 [9] J Leonel Ochoa-Solano, Jorge Olmos-Soto*, (2005), The functional property of Bacillus for shrimp feeds,Molecular Microbiology Laboratory, Department of Marine Biotechnology, Centro de Investigacio´n Cientı´fica y de Educacio´n Superior de Ensenada (CICESE), Ensenada, Baja California, Me´xico [10] Laurent Verschuere , Geert Rombaut , Patrick Sorgeloos , Willy Verstraete , (2000), Probiotic Bacteria as Biological Control Agents in Aquaculture, Microbiol Mol Biol Rev, 64(4), pp 655–671 [11] Lightner D.V., Redman R.M., Pantoja C.R., Noble B.I., Tran L (2012), Early mortality syndrome affects shrimp in Asia, Global Aquaculture Advocate, pp 40 [12] Loc T., Linda N., Rita M R., Leone L M., Carlos R P., Kevin F., Lightner D.V.* (2013), Determination of the infectious nature of the agent of acute hepatopancreatic necrosis syndrome affecting penaeid shrimp, Diseases Of Aquatic Organisms, 105, pp 45–55 [13] Mooney, A (2012), An emerging shrimp disease in Vietnam, microsporidiosis or liver disease? Available at: http://aquatichealth.net/issue/38607 [14] Purivirojkul W., and Areechon N (2007) Application of Bacillus spp isolated from the intestine of blacktiger shrimp (Penaeus monodon Fabricius) from natural habitat for control pathogenic bacteria in aquaculture, Kasetsart J (Nat Sci.) 41, pp 125-132 [15] Vichai Domrongpokkaphan* and Penkhae Wanchaitanawong, (2006) In vitro Antimicrobial Activity of Bacillus spp Against Pathogenic Vibrio spp in Black Tiger Shrimp (Penaeus monodon), Kasetsart J (Nat Sci.) 40, pp 949 – 957 [16] Witte W ,Klare I ,Werner G (1999) Selective pressure by antibiotics as feed additives, Infection27 (Suppl 2), pp 35–38  Nguồn internet: [17] http://www.fao.org/news/story/en/item/175416/icode/ Trang TP.HCM, ngày …… tháng …… năm …… Xác nhận GVHD Chữ ký sinh viên (Ký ghi rõ họ tên) Trang