Phân lập, xác định vi khuẩn gây bệnh thối mềm trên lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) và đánh giá hiệu quả ức chế của một số chủng xạ khuẩn

Bệnh thối mềm do vi khuẩn là một trong những bệnh phổ biến và gây ảnh hưởng lớn trên nhiều loại cây trồng khác nhau bao gồm cả hoa lan, trong đó vi khuẩn gây thối mềm xâm nhập vào mô thực vật, gây thối mềm thông qua vết thương. Nghiên cứu này nhằm xác định vi khuẩn gây bệnh thối mềm trên lan Phi Điệp và tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh.

Vietnam J Agri Sci 2022, Vol 20, No 1: 74-81 Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2022, 20(1): 74-81 www.vnua.edu.vn PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH VI KHUẨN GÂY BỆNH THỐI MỀM TRÊN LAN PHI ĐIỆP (Dendrobium anosmum) VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUÂ ỨC CHẾ CỦA MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN Phạm Hồng Hiển1, Diêm Đăng Trường2, Dương Văn Hoàn2, Trần Thị Đào2, Nguyễn Thị Thu2, Nguyễn Xuân Cảnh2* Ban Khoa học Hợp tác quốc tế, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam * Tác giả liên hệ: nxcanh@vnua.edu.vn Ngày nhận bài: 20.07.2021 Ngày chấp nhận đăng: 09.12.2021 TÓM TẮT Bệnh thối mềm vi khuẩn bệnh phổ biến gây ảnh hưởng lớn nhiều loại trồng khác bao gồm hoa lan, vi khuẩn gây thối mềm xâm nhập vào mô thực vật, gây thối mềm thông qua vết thương Nghiên cứu nhằm xác định vi khuẩn gây bệnh thối mềm lan Phi Điệp tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả đối kháng với vi khuẩn gây bệnh Từ 05 mẫu lan Phi Điệp có triệu chứng bị bệnh thối mềm thu thập Bắc Giang, chủng vi khuẩn gây bệnh phân lập, xác định khả gây bệnh phương pháp lây nhiễm nhân tạo định danh Bacillus pumilus VK3, B altitudinis VK5B Bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch, tuyển chọn chủng xạ khuẩn XK7 có khả đối kháng với hai chủng vi khuẩn B pumilus VK3 B altitudinis VK5B gây bệnh lan Phi Điệp với đường kính vịng đối kháng 17 ± 0,07mm 14 ± 0,05mm Từ khoá: Bệnh thối mềm, lan Phi Điệp, Bacillus pumilus, Bacillus altitudini, xạ khuẩn đối kháng Isolation and Identification of Soft Rot Bacteria on Dendrobium Anosmum Orchid and Evaluation of Inhibitory Effects of Some Actinomycetes ABSTRACT Bacterial soft rot is one of the most common diseases and mainly affects plants including orchid Dendrobium anosmum The bacteria causing soft rot penetrates plant tissue, causing soft rot through the wound This study aimed to íolate and identify bacterial strains capable of causing soft rot disease on orchids and select actinomycetes capable of antagonizing pathogenic bacterial strains From five samples of orchid leaves showing symptoms of soft rot disease collected in Bac Giang, two strains of bacteria capable of causing soft rot disease were-isolated and the pathogenicity determined by artificial re-infection method Bacterial strains were identified as Bacillus pumilus VK3 and B altitudinis VK5B By using the disk-diffusion method, from six Streptomyces strains, XK7 Streptomyces strain was selected for its antagonistic effect against B pumilus VK3 and B altitudinis VK5B-with the diameters of clear zone of 17 ± 0,07mm and 14 ± 0,05mm, respectively Keywords: Soft rot, Dendrobium anosmum, Bacillus pumilus, Bacillus altitudini, Streptomyces ĐẶT VẤN ĐỀ Hoa lan lồi thực vêt có hoa quan trọng nhỗt v mt kinh t trờn th gii (Eum & cs., 2011) Ở nước nhiệt đới, hoa lan tr thnh loọi cõy cõnh xuỗt khốu chớnh v nhu cỉu hoa cít cành họ tëng lên 74 nhanh chóng nëm qua Là lội cânh trồng chêu, hoa lan trở thành lội có giá trð quan trọng thð trường hoa Trong thêp kỷ qua, doanh số bán hoa lan Hoa Kỳ tëng lên khoâng 80% từ 70 triệu USD nëm 1997 lên 126 triệu USD nëm 2007 (Palma & cs., 2010) Theo số liệu thống kê Vụ Kế hoäch Phạm Hồng Hiển, Diêm Đăng Trường, Dương Văn Hoàn, Trần Thị Đào, Nguyễn Thị Thu, Nguyễn Xuân Cảnh thuộc Bộ NN&PTNT Việt Nam trồng lan cít cành Dendrobium Mokara 1ha cho doanh thu trung bình từ 500 triệu - tỵ đồng/ha/nëm (Đào Thanh Vån & Đặng Thð Tố Nga, 2008) Các bệnh ânh hưởng đến hoa lan bao gồm thối rễ, thối thân, giâ hành, đốm cháy (Keith & cs., 2005) Các bệnh vi khuèn phổ bin v quan trng nhỗt trờn cõy lan bao gm thối nhũn Pectobacterium carotovorum, Dickeya chrysanthemi Pantoae cypripedii đốm nâu Acidovorax avenae subsp Cattleyae (Simone & Burnett, 2002; Cating & Palmateer, 2011; Pulawska & cs., 2013) Thối mềm vi khuèn yếu tố hän ch sõn xuỗt lan S phỏt trin triu chng nhanh chịng thường dén đến tồn bð chết (Cating & cs., 2012) Bệnh thối nhũn gåy triệu chứng nghiêm trọng lan Vũ Nữ (Oncidium Gower Ramsey), loài lan phổ biến Đài Loan (Chang & cs., 2011; Liau & cs., 2003), đặc biệt nhng ỗm ỏp vi ốm cao Tuy nhiờn, iu tra quy mụ ln cho thỗy tỏc nhõn gây bệnh thối mềm vi khuèn lan Vũ Nữ Dickeya sp Hoa Kỳ (Cating & Palmateer, 2011) Ở nước ta đã cò nghiên cứu bệnh thối mềm số lồi lan thơng thường lan Hồ Điệp, lan Hài vi khuèn P carotovora gåy ra, chưa cò nghiên cứu têp chung vào loài lan Phi Điệp ang em lọi giỏ tr cao cho ngi sõn xuỗt Hiện nay, việc sử dụng chế phèm sinh học từ vi sinh vêt đối kháng để kiểm sốt mỉm bệnh häi trồng phương pháp ngày phổ biến nhờ có ưu điểm khơng chỵ kinh tế mà cịn khía cänh môi trường Việc nghiên cứu ứng dụng xä khuốn Streptomyces i khỏng nỗm bnh ang rỗt cú trin vọng xä khuèn có khâ nëng đối kháng mänh thông qua việc tiết sân phèm hữu đa däng (Shimizu & cs., 2008) Các chủng xä khuèn xác đðnh có khâ nëng đối kháng với chủng vi khuèn gây bệnh thối mềm như: Streptomyces spp RoN, Streptomyces spp G1P Streptomyces spp N1F có khâ nëng ức chế Bacillus pumilus OD23 gây bệnh thối mềm khoai tây (Babana & cs., 2011) Chủng Streptomyces halstedii AJ-7 đánh giá cị khâ nëng kiểm sốt nỗm P capsici gõy bnh trờn cõy t ú (Joo, 2005) Sử dụng chủng vi sinh vêt đối kháng phương pháp thân thiện với mơi trường có tác dụng việc giâm số lượng vi khuèn gây bệnh nhiều vườn lan (Nuryani & cs., 2018) Mục tiêu nghiên cứu phân lêp, xác đðnh chủng vi khuèn gây bệnh, tuyển chọn chủng xä khuèn có khâ nëng đối kháng với chủng vi khuèn gây bệnh thối mềm lan Phi Điệp PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Phân lập vi khuẩn gây bệnh 2.1.1 Phân lập vi khuẩn Phương pháp phån lêp vi khuèn gây bệnh thực theo phương pháp mô tâ Lin & cs (2015) Các mộu lan Phi ip cú dỗu hiu b bnh thi mềm thu thêp từ vườn lan täi Bíc Giang Mơ bð nhiễm bệnh (không × 1cm2) cít từ mép mơ thối mềm khử trùng bề mặt bìng 70% etanol 10 giây, sau ũ c t 1ml nc cỗt kh trựng phút Những méu sau cít nhó c t lờn cỏc ùa mụi trng LB (cao nỗm men 5,0g, peptone 10,0g, NaCl 10,0g), nuôi 30C 48 gi Cỏc khuốn lọc riờng r c cỗy chuyn sang mơi trường LB để làm thn 2.1.2 Lây nhiễm bệnh nhân tạo Các chủng vi khuèn phân lêp nuụi cỗy mụi trng LB lúng 30C 48 giờ, sau đò lây nhiễm nhân täo cho lan Phi Điệp để xác đðnh tác nhân gây bệnh theo phương pháp mô tâ Alic & cs (2017) Các chủng vi khuèn xác đðnh có khâ nëng gồy bnh thi mm, nu xuỗt hin dỗu hiu thi mềm, bọng nước xung quanh vð trí lây nhiễm 2.2 Nghiên cứu số đặc điểm sinh học vi khuẩn gây bệnh Xác đðnh hình thái khuèn läc, tế bào vi khuèn: Các chủng vi khuèn có khâ nëng gồy bnh c nuụi cỗy trờn mụi trng LB 30C 48 để quan sát đặc điểm hình thái, màu síc khn läc, hình thái tế bào xác 75 Phân lập, xác định vi khuẩn gây bệnh thối mềmtrên lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) đánh giá hiệu ức chế số chủng xạ khuẩn đðnh bìng cách nhuộm Gram quan sát kính hiển vi Xác đðnh khâ nëng di động vi khuốn: Cỏc chng vi khuốn c cỗy trờn mụi trng thọch mm cha 0,5% agar Dựng que cỗy thợng lỗy sinh ca vi khuốn, cỗy ồm sồu vo hổu hết chiều dài ống nghiệm Ủ 30C 24 Vi khuèn có khâ nëng di động mọc lan khúi ng cỗy v lm c mụi trng xung quanh Vi khn khơng có khâ nëng di động chợ mc quanh ng cỗy 2.3 nh danh vi khun gây bệnh Chủng vi khuèn gây bệnh phân lêp nuụi cỗy trờn mụi trng LB lúng, sau 48 gi tiến hành ly tâm 10.000 rpm/phút, 10 phút 4C, thu tế bào DNA tổng số chủng vi khuèn tách theo phương pháp Masoomi & cs (2016), gen mã hoá cho vùng 16S rRNA chủng vi khuèn khuếch đäi bìng phương pháp PCR sử dụng cặp mồi 27F (5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’) 1492R (5’- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’) Phân ứng thực theo chu trình nhiệt: 95C - phút, 29 chu kỳ (95C - 30 giây, 56C - 30 giây, 72C - phút), 72C 10 phút, giữ méu 4C Sân phèm phân ứng PCR kiểm tra bìng điện di gel agarose 1% có nhuộm bìng RedSafe hiệu điện 80V 50 phút Kích thước độn DNA thu sau phân ứng PCR so sánh với thang DNA chuèn Sân phèm PCR tinh säch giâi trình tự bìng phương pháp Sanger câi tiến täi 1st BASE (Singapore) So sánh trình tự gen tương ứng sở liệu Genbank nhờ công cụ BLAST (https://www.ncbi nlm.nih.gov) Sử dụng phæn mềm MEGAX để xây dựng cåy xác đðnh mối quan hệ di truyền, với độ tin cêy tính bìng tht tốn Bootstrap với 1.000 lỉn lặp läi Dựa vào phân lội giá trð Bootstrap để xác đðnh mối quan hệ di truyền chủng nghiên cứu 2.4 Đánh giá khả ức chế vi khuẩn gây bệnh số chủng xạ khuẩn Phương pháp khuếch tán đïa thäch sử dụng cho đánh giá khâ nëng ức chế vi khuèn 76 gây bệnh thối mềm lan Phi Điệp chủng xä khuèn thực theo phương pháp mô tâ Balouiri & cs (2015) Khâ nëng ức chế vi khuèn gây bệnh chủng xä khuèn nghiên cứu thể thơng qua đường kính vịng vơ khn (vịng trịn suốt bao quanh giếng thäch) tính bìng cơng thức D – d (mm) đị D đường kính vịng vơ khn (mm), d đường kính lỗ thäch (mm) Thí nghiệm lặp läi ba lỉn với đối chứng dðch mơi trường khơng ni cỗy xọ khuốn S liu c thu thờp v x lý bìng phỉn mềm thống kê Statgraphics Centrution 16.2 Phån tích phương sai (ANOVA) kiểm đðnh LSD sử dụng để kết luên sai khác trung bình nghiệm thức mức độ ý nghïa P