ĐỒ án CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM (9)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DUY TÂN KHOA DƯỢC BỘ MÔN TRANH TÀI GIẢI PHÁP ĐỀ TÀI: TÌM HIỂU VỀ CÂY RAU MÁ Sinh viên thực hiện: Giao viên hướng dẫn: NGUYỄN THỊ THU ÂU HỒ TRÚC QUỲNH NGUYỄN THỊ MINH DIỆU Lớp: YDH3-K20 LỜI MỞ ĐẦU Rau Má loại quen thuộc nhiều nước giới Việt Nam Cây mọc tự nhiên khắp nơi từ vùng hải đảo ven biển đến vùng núi Nhiều cơng trình chứng minh Rau Má có tác dụng phòng ngừa điều trị nhiều loại bệnh khác Ngày có nhiều nghiên cứu khả sản xuất, sử dụng Rau Má thành phần trích ly từ Rau Má, flavonoid biết nhóm sắc tố tự nhiên phân bố rộng rãi loài thực vật, có vai trị lớn việc tạo màu sắc nhiều loại hoa có nhiều tác dụng sinh học đặc biệt quan trọng Ngày với phát triển mạnh mẽ khoa học kỹ thuật công nghệ, biệt dược từ nguồn tổng hợp có tác dụng ức chế miễn dịch sử dụng rộng rãi ngày nhiều, nhiên chúng đắt tiền có nhiều tác dụng phụ gây nguy hiểm Vì xu hướng tìm hoạt chất thiên nhiên từ nguồn gốc thảo mộc có tác dụng thuốc tổng hợp độc dễ dung nạp, người cao tuổi người có bệnh mạn tính Chính nhóm sắc tố tự nhiên flavonoid nhóm sắc tố khơng phần thu hút ý quan tâm nhiều nhà nghiên cứu Hiện có đề tài nghiên cứu khả sản xuất flavonoid từ nhiều loại cỏ, nhiên Rau Má Lá Sen nguồn nguyên liệu khảo sát định danh nước ta thời gian ngắn gần chưa nghiên cứu hóa học Vì mở rộng việc nghiên cứu nguồn nguyên liệu mới, cần thiết Đây lý mà chúng em chọn đề tài “Khảo sát hợp chất họ flavonoid Rau Má” với đề tài chúng em mong muốn góp phần vào việc khảo sát có mặt hàm lượng hợp chất họ flavonoid Rau Má CHƯƠNG TỔNG QUAN I Giới thiệu chung Rau Má 1.1 Tên gọi Tên khoa học: Cetella asiatica Tên đồng nghĩa: Hydrocotyle asiatica L Tên khác: Liên Tiền Thảo, Tích Tuyết Thảo, Phắc Chèn (Tày) Tên nước ngoài: Indiana pennywort (Anh), Centelle Họ: Hoa tán (Apiaceae) Hình 1: Cây Rau Má 1.1.2 Vị trí Rau Má  Cây ưa ẩm, chịu nóng, thường mọc thành đám vườn, bãi sông, nương rẫy, bờ ruộng cao ven rừng Rau Má sinh trưởng mạnh mùa mưa ẩm 1.1.3 Đặc điểm thực vật  Thân thảo nhỏ, mọc bị, có lơng non, bén rễ mấu Lá mọc so le, thường tụ họp – mấu, phiến nhẵn, mép khía tai bèo, mảnh, dài – cm, có – cm  Cụm hoa gồm tán đơn mọc riêng lẻ, tán mang 1- hoa, hoa thường có màu trắng phớt đỏ, hoa khơng có cuống, cánh hoa hình tam giác trái xoan, nhị có nhị ngắn, bao phấn hình mắt chim, bầu hình cầu  Quả màu nâu đen, đỉnh lõm, có – cạnh lồi, nhẵn có lơng nhỏ  Mùa hoa từ tháng đến tháng 1.1.4 Phân bố  Hydrocotyle asiatica L phân bố tập trung vùng Bắc Phi, số vùng nhiệt đới Nam Đông Nam Châu Á tỉnh Nam Trung Quốc  Ở Việt Nam, Rau Má loại quen thuộc Cây mọc tự nhiên khắp nơi, từ vùng hải đảo, ven biển đến vùng núi Ở vùng đồng sông Cửu Long phát hai loại giống Rau Má định dạnh, Rau Má Lá Sen Hydrocotyle bonariensis L Rau Má Lá Sen Hydrocotyle vulgaris L  Theo tác giả Phạm Hoàng Hộ, Võ Văn Chi, Trần Hợp, [1,3,5] Việt Nam có hai mươi lồi Rau Má, là: Hydrocotyle asiatica, Hydrocotyle chevalieri (Chern) Tard, Hydrocotyle chinensis (Dunn) Craib, Hydrocotyle nepalensis Hook, Hydrocotyle petelotii Tard, Hydrocotyle pseudosanicula De Boiss, Hydrocotyle sibthorpioides Lamk, siamica Craib, Hydrocotyle Hydrocotyle tonkinensis Tard, Hydrocotyle wilfordii Maxim 1.1.5 Thành phần hóa học Rau Má thường chứa hợp chất thuộc nhiều nhóm hóa học khác nhau, sau bảng thành phần hóa học bảng hợp chất hóa học Rau Má [16-17] Bảng 1: Thành phần hóa học Rau Má Thành phần Nước Protei n Gluci d Chất xơ Khống tồn phần Hàm lượng (%) 88, 3,2 1,8 4,5 2,3 Bảng 2: Các hợp chất hóa học Rau Má Saponin triterpenic, asiaticosid (madecassol), madecassoid, irahmosid, Brahminosid Triterpen Ngồi cịn có thankunisid isothankunisid Khi thủy phân, thankunisid cho acid thankunic, glucose rhamnose Các acid triterpenic Rau Má acid asiatic, acid Phần mặt đất Rau Má mọc Malaysia có 41 Tinh dầu thành phần, 80% sesquiterpen (thành phần chính) 10% germacren-D Cây Rau Má mọc Srilanca chứa tinh dầu Các hợp chất polyacety len có -copaen 14%, -caryophylen Rau Má có 14 chất polyacetylen, chất nhận dạng là: acetate; 3,8- pentadeca-2,9-dien-4,6-diyn-1-ol diacetoxypentadeca-1,9-dien-4,6- diyn; 3-hydroxy-8-acetoxy- pentadeca-1,9-dien- 4,6-diyn; 3-hydroxy-10-acetoxy- pentadeca-1,8Các flavonoid gồm: kaempferol, Flavonoi quercetin, 3-glucosyl d quecetin, 3-glucosyl-kaempferol Các hợp chất steroid gồm: -sitosterol, Steroid stigmasterol campestrol Các glyceride Dầu béo lignoceric, Acid amin Các nhóm khác acid oleic, linoleic, palmitic, stearic, linolenic, elaidic Acid glutamic, serin, alanin Tanin, carotenoid, (hydro cotylin), vitamin oligosaccharide (centelose) C, alkaloid 1.3 Công dụng rau má 1.3.1 Các thử nghiệm tiền lâm sàng 1.3.1.1 Làm lành vết thương Dịch chiết nước rau má có tác dụng làm lành vết thương Các nghiên cứu chuột cho thấy dịch chiết rau má có tác dụng làm tăng sinh tế bào tăng tổng hợp collagen vị trí vết thương Asiaticoside thành phần rau má có tác dụng làm lành vết thương cách tăng hình thành collagen hình thành mạch [28] Ngồi ra, asiaticoside cịn có tác dụng làm tăng sức bền da hình thành, thúc đẩy việc chữa lành vết thương, ức chế trình viêm gây phì đại sẹo cải thiện tính thấm mao mạch 1.3.1.2 Tác dụng an thần Rau má có tác dụng an thần Tác dụng chủ yếu có mặt brahmoside dẫn chất [27] 1.3.1.3 Tác dụng chống trầm cảm Thử nghiệm chuột cho thấy triterpen rau má có tác dụng chống trầm cảm Nguyên nhân liên quan đến cải thiện chức trục hạ đồi-tuyến yên-thượng thận (HPA) làm tăng khả dẫn truyền thần kinh [7] 1.3.1.4 Tác dụng chống oxy hóa Rau má có tác dụng tốt hệ thần kinh, làm tăng khả tập trung, chống lão hóa Trong nghiên cứu chuột, sử dụng dịch chiết rau má theo đường uống với liều 50 mg/kg/ngày 14 ngày giúp tăng đáng kể enzym chống oxy hóa, superoxide dismutase (SOD), catalase glutathione peroxidase (GSHPx) [17] 1.3.1.5 Tác dụng chống loét dày Dịch chiết nước rau má có hiệu việc ức chế tổn thương dày gây ethanol Các tác giả kết luận chiết CA củng cố hàng rào niêm mạc dày giảm tác hại gốc tự [8] 1.3.1.6 Tác dụng giảm đau kháng viêm Các nghiên cứu gần cho thấy dịch chiết rau má có tác dụng giảm đau chống viêm Điều hoàn toàn phù hợp với kinh nghiệm sử dụng rau má bệnh viêm khớp Khi nghiên cứu mơ hình chuột gây viêm khớp, madecassoside giảm bớt mức độ nghiêm trọng bệnh, giảm bớt xâm nhập tế bào viêm tăng sinh hoạt dịch bảo vệ chống lại phá hủy khớp [19] Acid asiatic acid madecassic cho thấy tác dụng chống viêm cách ức chế enzym (iNOS, cyclooxygenase-2 (COX-2)), interleukin (IL-6, IL-1β), yếu tố hoại tử khối u cytokine (TNF -α) [35; 37] Dịch chiết ethanol rau má liều 100 mg/kg trọng lượng thể cho thấy hoạt động chống viêm chuột tương tự ibuprofen [12] Acid 3,5-dicaffeoyl-4-malonylquinic, chiết xuất từ rau má chứng minh tác dụng có lợi bệnh viêm ruột chuột [9] Trong động vật thí nghiệm asiaticoside có tác dụng hạ sốt ức chế đáp ứng viêm, bao gồm sản sinh TNF-α IL-6, hoạt tính myeloperoxidase gan [34] 1.3.1.7 Hoạt động miễn dịch Saponin triterpenoid rau má cho thấy tác dụng điều hòa miễn dịch [22] Rau má tăng đáng kể số thực bào tổng số bạch cầu chuột [18] Dịch chiết nước rau má làm tăng đáng kể phát triển sản xuất IL-2 TNF-α tế bào máu đơn nhân ngoại vi người dịch chiết ethanol có tác dụng ức chế [25] Acid asiatic dịch chiết ethanol dịch chiết dichloromethane từ rau má cho thấy tác dụng ức chế ba loại DNA vòng chủ yếu, có chức bộc lộ dạng protein cytochrome P450 (CYP2C9, CYP2D6 CYP3A4) loại protein có vai trị quan trọng q trình chuyển hóa người [20] 1.3.1.8 Hoạt động kháng vi sinh vật Rau má có hoạt tính kháng khuẩn gram dương gram âm, ví dụ ức chế tăng trưởng vi khuẩn Bacillus subtilis Pseudomonas aeruginosa, P cichorii Escherichia coli [11] Dịch chiết methanol có tác dụng Staphylococcus aureus S aureus kháng methicillin [38] Hoạt tính kháng virus báo cáo với chiết xuất dung dịch nước rau má virut Herpes simplex type [11] 1.3.1.9 Tác dụng chống tăng đường huyết: Sử dụng acid asiatic glibenclamide chuột gây tiểu đường đường uống 45 ngày giúp ngăn chặn hoạt động thay đổi enzyme quan trọng (glucose-6-phosphatase fructose-1,6-bisphosphatase) gây tăng đường huyết [26] 1.3.1.10 Tác dụng hạ huyết áp Nghiên cứu tiến hành chuột gây tăng huyết áp N-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) L-NAME gây tăng đáng kể huyết áp động mạch, huyết áp tâm thu huyết áp tâm trương, dịch chiết rau má (liều 16 g/20 ml/kg) quercetin lại có tác dụng đối ngược Nghiên cứu chứng minh tác dụng hạ huyết áp rau má [16] 1.3.1.11 Tác dụng nhiệt Asiaticoside có tác dụng hạ sốt Thí nghiệm tiến hành mơ hình chuột gây sốt lipopolysacharide so sánh với paracetamol Asiaticoside sử dụng liều 5, 15 45 mg/kg Kết cho thấy asiaticoside có tác dụng hạ sốt tất liều thử nghiệm có tác dụng tương tự paracetamol (50 mg/kg) liều 45 mg/kg [39] 1.3.1.12 Tác dụng chống ung thư Có nhiều báo cáo cho thấy tác dụng gây độc tế bào ung thư in vitro dịch chiết từ rau má với loại dung môi khác Dịch chiết methanol cho thấy khả gây chết tế bào theo chương trình, dịng tế bào ung thư vú MCF-7 [4], thành phần triterpene từ dịch chiết ức chế tăng sinh tế bào ung thư tử cung HeLa, ung thư dày MK-1 người [36] Dịch chiết nước có tác dụng hạn chế hình thành khối u trực tràng chuột [5] Asisatic acid gây độc tế bào ung thư da người SK-MEL-2 ung thư đại trảng người SW480 [21; 33], cịn asiaticosid giúp tăng cường tác dụng thuốc chống ung thư vincristine tế bào ung thư [15] 1.4 Các kết thử nghiệm lâm sàng Một số chế phẩm từ rau má thử tác dụng lâm sàng gồm có: - TTFCA (total triterpenoid fraction of Centella asiatica): phân đoạn tổng chứa triterpenoid - TECA (titrated extract of Centella asiatica): dịch chiết chuẩn hóa từ rau má, chứa thành phần asiaticoside, madecassic asiatic acid - Madecassol®: chế phẩm dạng gạc (10 x 10 cm) tẩm hỗn hợp TECA Kết quả:  Ống sau thêm thuốc thử Sibata, đun nóng thấy có vịng màu hồng từ từ xuất chuyển sang đỏ cam đỏ tím, chứng tỏ có diện flavonoid  Ống sau thêm giọt HCl, hỗn hợp chuyển màu vàng đậm sang da cam chứng tỏ có flavonoid Hình 26: Định tính flavonoid thơ Hydrocotyle bonariensis Hình 27: Định tính flavonoid thơ Hydrocotyle vulgaris K ết luậ n: Các flavonoid thô Hydrocotyle bonariensis Hydrocotyle vulgaris cho kết dương tính giống với thuốc thử Sibata dung dịch H2SO4 đậm đặc Sau bảng tóm tắt kết định tính flavonoid thô Hydrocotyle bonariensis Hydrocotyle vulgaris Bảng 16: Kết định tính flavonoid thơ Flavonoid thơ Thuốc thử Sibat a Cây Hydrocotyl e ++ bonariensis + Cây Hydrocotyle vulgari s ++ + Dung dịch H2SO4 đậm đặc ++ + ++ + CHƯƠNG SẮC KÝ CỘT CAO FLAVONOID THÔ CỦA CÂY RAU MÁ LÁ SEN HYDROCOTYLE BONARIENSIS Q trình sắc ký cột cao flavonoid thơ Hydrocotyle bonariensis với mục tiêu phân lập flavonoid riêng rẽ có cao flavonoid thơ 3.1 Chuẩn bị ngun liệu  Chất phân tích: cao flavonoid thơ (trích dung dịch acetate chì) 1,24 gam  Cột sắc ký: dài 50 cm, đường kính 3,50 cm  Chất hấp phụ nạp vào cột: 10,00g silicagel 60 GF254 (0,040 – 0,063 mm) Merck (Đức) sấy khô nhiệt độ khoảng 1100C, sau ngâm hệ C:Me = 9:1 nhiều cho trương nở trước nạp vào cột  Dung môi giải ly: Dung môi giải ly ban đầu sử dụng hệ C:Me = 9:1 hệ dung mơi có tính phân cực tăng dần 3.2 Sắc ký cột cao flavonoid thô Cột cao flavonoid thô nhồi phương pháp nhồi cột ướt  Chuẩn bị cột sẵn sàng giá đỡ, cột lót miếng bơng  Rót tay silica gel vào cột  Ổn định cột hệ dung môi giải ly C:Me = 9:1 nhiều  Sau nạp từ từ chất phân tích vào cột  Sử dụng hệ dung mơi giải ly cột có độ phân cực tăng dần kể từ hệ dung môi C:Me = 9:1 Dung môi giải ly hứng lọ 50 ml có đánh số thứ tự, dung dịch lọ đem cô quay áp suất sắc ký lớp mỏng mỏng hình Thuốc thử H2SO4 10% methanol Những lọ có vết sắc ký, có Rf giống gom chung thành phân đoạn Hình 28: Sắc ký mỏng cao flavonoid thơ Hình 29: Sắc ký cột cao flavonoid thơ Kết q trình sắ t ký cộ t Kết Phâ n Số thứ đoạ n tự lọ giải ly 1 - 20 cột C:Me = 9:1 Dung Dạng môi chất 21 - 35 C:Me = 8:2 36 104 C:Me = 8:2 105 130 C:Me = 8:2 Dung môi giải ly mỏng Sáp màu C:Me = 2:1 Ghi giải ly ch Khơng mỏng có xan Sáp màu C:Me = 2:1 vết trắn Sáp màu C:Me = 2:1 vết trắn Sáp màu C:Me = 2:1 vết trắn vết ú Không khảo sát Không khảo sát Không khảo sát Không khảo sát Tinh thể 131 222 C:Me = 7:3 trắng lẫn 223 316 C:Me = 7:3 màu Tinh thể C:Me = 1:1 vết C:Me = 1:1 vết Khơng khảo sát Khảo trắng tím màu sát sen Bảng 17: Kết trình sắc ký cột Phân đoạn sắc ký mỏng với thuốc thử hình H2SO4 10% methanol với hệ dung môi giải ly mỏng C:Me = 1:1 cho kết vết trịn màu tím sen có Rf = 0,44 Hình 30: Kết sắc ký mỏng phân đoạn Kết luận Quá trình sắc ký cột cao flavonoid thơ thu vết trịn màu tím sen phân đoạn Tuy nhiên thời gian có hạn chất thu cịn ít, nên chúng em chưa tiến hành tinh chế chất thu được, mong bạn sau tiếp tục trình KẾT LUẬN PHẦN KẾT LUẬN  Điều chế mẫu cao gồm: Cao methanol tổng, cao petroleum ether, cao chloroform, cao ethyl acetate, cao buthanol, cao methanol cuối cao nước từ hai Rau Má Lá Sen Hydrocotyle bonariensis Hydrocotyle vulgaris phương pháp: phương pháp trích lỏng – lỏng (điều chế cao petroleum ether, cao chloroform, cao ethyl acetate, cao buthanol) phương pháp trích rắn – lỏng (trích phương pháp ngâm dầm điều chế cao methanol tổng, cao nước; trích Soxhlet điều chế cao petroleum ether, cao chloroform, cao ethyl acetate, cao methanol cuối) Kết thu thu suất cao trích từ phương pháp rắn – lỏng cao thu suất cao trích từ phương pháp lỏng – lỏng  Định tính diện flavonoid cao điều chế thuốc thử khác Cho kết dương tính cao methanol tổng, cao ethyl acetate, cao buthanol, cao nước cho kết âm tính cao petroleum ether cao chlorform  Trích flavonoid thơ từ cao methanol tổng hai phương pháp: Trích flavonoid dung dịch acetate chì trích flavonoid dung dịch kiềm có độ kiềm khác Kết cho thấy lượng flavonoid thơ trích từ methanol tổng chứa Hydrocotyle cao bonariensis nhiều Hydrocotyle vulgaris lượng flavonoid thơ thu từ phương pháp trích flavonoid dung dịch kiềm có độ kiềm khác có hiệu so với phương pháp trích flavonoid dung dịch acetate chì Thu suất flavonoid thơ thu từ phương pháp trích flavonoid dung dịch acetate chì sau: + Thu suất flavonoid thô Hydrocotyle bonariensis 15,50% + Thu suất flavonoid thô Hydrocotyle vulgaris 10% Thu suất flavonoid thô thu từ phương pháp trích flavonoid dung dịch kiềm có độ kiềm khác sau: + Thu suất flavonoid thô Hydrocotyle bonariensis 18,75% + Thu suất flavonoid thô Hydrocotyle vulgaris 13,75%  Sắc ký cột cao flavonoid thô Hydrocotyle bonariensis thu phân đoạn, phân đoạn thu vết trịn màu tím sen có Rf = 0,44 Tuy nhiên thời gian có hạn lượng chất thu nên chúng em chưa tiến hành tinh chế chất thu được, hi vọng bạn sau tiếp tục trình TÀI LIỆU THAM KHẢO  [1] Võ Văn Chi, Trần Hợp Cây cỏ có ích Việt Nam, tập I Nhà xuất giáo dục năm 1999 [2] Trần Thị Việt Hoa, Lê Thị Hồng Nhan, Nguyễn Thị Thanh Thuyền, Nguyễn Thị Mỹ Lữ Báo cáo khoa học Nghiên cứu tách chất màu tự nhiên từ hoa Hịe Khoa Cơng Nghệ Hóa Học Và Dầu Khí, Đại Học Bách Khoa Tp.HCM, năm 2003 [3] Phạm Hoàng Hộ Cây cỏ Việt Nam, tập II Nhà xuất trẻ năm 1972 [4] Tôn Nữ Liên Hương Luận án thạc sĩ [5] Đỗ Tất Lợi Những thuốc vị thuốc Việt Nam Nhà xuất y học, năm 2004 [6] Nguyễn Kim Phi Phụng Đại Học Phương pháp cô lập hợp chất hữu Quốc Gia TPHCM, năm 2007, trang 95 – 97 [7] Bộ môn Dược Liệu Trường đại học Y dược Thành Phố Hồ Chí Minh Phương pháp nghiên cứu liệu 2006 [8] Hiller K., Keipert M., Pfeifer.,(1917), Sponins of Hydrocotyle vulgaris, Pharmazie 26(12),780 [9] Rzadkowska-Bodalska Halina, Olechnowicz-Stepien Waleria, (1974) [10] Hiller K., Voigt Gabriele, Koeppel H., Otto A., (1979) [11]http://www goo gle.com.vn/search?hl=vi&as_qd r=all&q=+ %22 NGHI%C3% 8AN+C%E1%BB%A8U+TR%C3%8DCH+POLYPHENOL+T%E1%BB %AA+ TR%C3%80%22&btnG=T%C3%ACm+ki%E1%BA %BFm&meta= [12]http://209.85.175.104/search? q=cache:y5UM1rbsbSIJ:www.m etabo lom e.jp /s oftware/FlavonoidViewer/+ %22Flavonoid+is+synthesized+through+the+phenyl propanoidacetate+pathway+in+all+higher+plants.+ %22&hl=vi&ct=clnk&cd=1&gl=vn [13] http://suckhoecongdong.com /dinh-duong/vitam in-khoangchat.html [14] h ttp://phuocnhuan.jimdo co m/do wnload/76570003/B8++CAC+H+C+THU+CAP.pdf [15] http://www.nearfu turelaboratory.com /files/Flavono id_Propo sal_072706 pd f [16]http://www goo gle.com.vn/search? hl=vi&lr=&as_ qdr=all&q=related:www1 bsc.com.vn:8080/EDMS/webcorannc.nsf/885741814283a7ef47256dff0 034baff/9 574dcc3f4bc12154725734f003aedbb/$FILE/20070907-IMPBancaobach.pdf [17]h ttp://209.85.175.104/search? q=cache:JAo Jjq6cbHYJ:d ictionary.b achkhoato anthu.gov.vn/default.aspx%3Fparam %3D15F4aWQ9MjI3MTImZ3JvdXBpZD0 ma2luZD1zdGFydCZrZXl3b3JkPXI%3D%26page%3D1+%22RAU+M %C3%8 1%22&hl=vi&ct=clnk&cd=72&gl=vn ... máy xay thực phẩm Sau đó, bột trà cân với lượng thích hợp cho vào bình cầu, thêm dung mơi thực q trình trích ly Để tránh tượng nhiệt chiếu vi sóng liên tục, q trình chiếu sóng thực gián đoạn... điểm thực vật  Thân thảo nhỏ, mọc bị, có lơng cịn non, bén rễ mấu Lá mọc so le, thường tụ họp – mấu, phiến nhẵn, mép khía tai bèo, mảnh, dài – cm, có – cm  Cụm hoa gồm tán đơn mọc riêng lẻ, tán... có cuống, cánh hoa hình tam giác trái xoan, nhị có nhị ngắn, bao phấn hình mắt chim, bầu hình cầu  Quả màu nâu đen, đỉnh lõm, có – cạnh lồi, nhẵn có lơng nhỏ  Mùa hoa từ tháng đến tháng 1.1.4