sáng t3 nhóm 7 seminar

Mặc dù các xét nghiệm kháng nguyên nhanh, phân lập virus và xét nghiệm huyết thanh học có thể được sử dụng để chẩn đoán nhiễm H5N1 trên tất cả các phân nhánh virus, các phương pháp này đ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO SIMENAR

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP REALTIME RT-PCR ĐỂ NHẬN DẠNG ĐẶC HIỆU CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 TRÊN GIA

CẦM

TP.Thủ Đức, 10/2023

Ngành học : Công nghệ sinh học môi trường Môn học : Thiết bị và kĩ thuật CNSH

KS Trương Quang Toản

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO SIMENAR

Nhóm sinh viên thực hiện Nhóm 7 sáng thứ 3

Nguyễn Lâm Thanh Nhi 21126438

Trần Thị Hồng Phúc 21126472

LỜI CẢM ƠN

Em xin cảm ơn trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Khoa Khoa học Sinh học, TS Huỳnh Văn Biết – giảng viên môn Thiết bị và kỹ thuật Công nghệ sinh học và KS Trương Quang Toản đã tạo điều kiện cho nhóm có cơ hội thực hiện bài tiểu luận này, giúp nhóm có thêm nhiều kiến thức cũng như kỹ năng đọc hiểu tài liệu chuyên ngành trong quá trình học tập Bước đầu tham gia công tác nghiên cứu khoa học và còn hạn chế về kiến thức, kinh nghiệm nên sẽ có những thiếu sót mà nhóm không nhìn thấy được Nhóm em rất mong sự đóng góp của thầy và các bạn để báo cáo được hoàn thiện hơn Cuối cùng nhóm em xin chúc các thầy dồi dào sức khỏe Xin chân thành cảm ơn!

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 8

3.1 Đối tượng nghiên cứu 8

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay một nhánh virus đặt ra một thách thức cho chẩn đoán trong phòng thí nghiệm, vì các phương pháp phát hiện nhiễm H5N1 thường dựa vào sự khuếch đại đặc hiệu của nhánh của gen HA Mặc dù các xét nghiệm kháng nguyên nhanh, phân lập virus và xét nghiệm huyết thanh học có thể được sử dụng để chẩn đoán nhiễm H5N1 trên tất cả các phân nhánh virus, các phương pháp này đã hạn chế sử dụng để chẩn đoán thông thường vì không có khả năng phân nhóm, độ nhạy thấp và yêu cầu của các cơ sở phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp 3 Phương pháp tham chiếu được chấp nhận để chẩn đoán nhiễm H5N1 là real-time RT-PCR (rRT-PCR) Ở nghiên cứu của (Montserrat Agu¨ero và ctv, 2017) quy trình RT-PCR (RRT-PCR) thời gian thực để phát hiện gen N1 từ virus cúm gia cầm (AIV), dựa trên việc sử dụng mồi cụ thể và đầu dò TaqMan-MGB Theo khuyến cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), phương pháp khuếch đại sử dụng enzyme phiên mã ngược RT-PCR, là phương pháp phát hiện nhanh, chính xác chủng virus cúm A/H5N1, sản phẩm của phản ứng RT-PCR có thể sử dụng cho quá trình giải trình tự gen và xác định các yếu tố đột biến xảy ra trên gen và hạn chế những nguy cơ nhiễm chéo hoặc lây lan chủng virus cúm A/H5N1 so với các phương pháp thông thường như SRD, phản ứng ngưng kết hồng cầu gà (Lưu Thị Dung và ctv, 2011) Nghiên cứu của (Rongbao Gao và ctv, 2011) đã sử dụng RT-PCR để phát hiện gene HA của virus H5N1 vàkiểm soát chất lượng cho cúm gia cầm A (H5N1) RT-PCR và rRT-PCR Theo (Zhixun Xie và ctv, 2006) sử dụng phương pháp mRT-PCR đã được phát triển và tối ưu hóa để phát hiện virus cúm loại A, xét nghiệm đồng thời phân biệt các phân nhóm hemagglutinin H5, H7 và H9 của gia cầm Từ các lý thuyết, tài liệu trên

nghiên cứu này ứng dụng phương pháp RT-PCR (Reverse transcription - Polymerase Chain Reaction) là phương pháp được sử dụng để phát hiện vật liệu di truyền của virus trong đa dạng loại mẫu Nhằm phát hiện được sự tồn tại của virus H5N1 trước khi chúng gây ra triệu chứng rõ ràng cho vật nuôi Bên cạnh đó, phản ứng RT-PCR phát hiện vi rút cúm gia cầm trên cơ sở phát hiện các đoạn gen H5 và N1 Nghiên cứu này nhằm xác định quá trình khuếch đại DNA và kết quả phát hiện virus cúm gia cầm bằng Real-time PCR

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về virus

Hạt virus có cấu tạo đơn giản gồm vỏ, vỏ bọc ngoài và lõi là ARN sợi đơn âm Vỏ virus có chức năng bao bọc và bảo vệ vật chất di truyền ARN, bản chất cấu tạo là màng lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm được đặc hiệu hóa gắn các protein màng của virus Trên bề mặt có khoảng 500 “gai mấu” nhô ra và phân bố dày đặc, mỗi gai mấu dài khoảng 10 - 14 nm có đường kính 4 - 6 nm, đó là những kháng nguyên bề mặt vỏ vi rút, bản chất cấu tạo là glycoprotein gồm: HA, NA, MA (matrix) và các dấu ấn khác của virus Có sự phân bố không đồng đều giữa các phân tử NA và HA (tỉ lệ khoảng 1NA/4HA), đây là hai loại protein kháng nguyên có vai trò quan trọng trong

quá trình xâm nhiễm của virus ở tế bào cảm nhiễm

Bệnh cúm gia cầm (H5N1) là bệnh do virus cúm type A, thuộc họ

Orthomyxoviridae gây ra trên các loài gia cầm, thủy cầm và chim hoang dã Biến chủng

virus cúm gây bệnh ở gia cầm được chia theo tính gây bệnh với mực độ độc lực khác nhau của virus mà người ta xếp loại: bệnh cúm gia cầm độc lực cao, tỉ lệ chết rất cao và cúm gia cầm độc lực thấp với triệu chứng bệnh không rõ rệt và tỷ lệ chết thấp Virus cúm A thuộc subtype H5N1, hệ gen ARN có khả năng biến đổi rất nhanh, tạo ra những chủng, nhánh mới là nguyên nhân gây ra các ổ dịch cúm gia cầm

Bệnh cúm gia cầm có tính lây truyền rất nhanh và mạnh Trong đó, thủy cầm là nguồn mang mầm bệnh chính Gia cầm nhiễm bệnh chủ yếu thông qua tiếp xúc trực tiếp giữa gia cầm mẫn cảm với gia cầm bị bệnh hoặc phân và chất thải của gia cầm bị bệnh Các loài chim hoang dã cũng bị mắc bệnh và là nguồn lây lan mầm bệnh cho gia cầm và thủy cầm Theo FAO, tính từ khi xuất hiện dịch cúm gia cầm ở Châu Á đến tháng 3- 2006, đã có hơn 200 triệu con gia cầm bị chết hoặc tiêu hủy Bệnh đã bùng phát ở các nước như: Trung quốc, Thái Lan, Campuchia, Indonesia, Malaysia, Lào, Việt Nam Bệnh cúm gia cầm xuất hiện ở Việt Nam đầu tiên vào cuối tháng 12/2003 tại tỉnh Hà Tây và hai tỉnh phía Nam là Long An và Tiền Giang Sau đó bệnh lan dần ra các tỉnh/thành trong cả nước Chỉ trong vòng hai tháng, dịch cúm gia cầm đã xuất hiện ở

54/64 tỉnh thành với tổng số gia cầm và thiêu hủy hơn 43,9 triệu con, chiếm 16,79% tổng đàn trong cả nước và đe dọa sức khỏe của con người

2.2 Phương pháp Real-time RT-PCR

Kỹ thuật Real–time RT-PCR là kỹ thuật mà kết quả khuếch đại DNA đích được hiển thị sau mỗi chu trình nhiệt của phản ứng PCR Kết quả khuếch đại được quan sát thông qua các tín hiệu huỳnh quang được giải phóng trong quá trình phản ứng PCR xảy ra Các tín hiệu này được phát hiện và ghi lại dưới dạng biểu đồ, từ đó có thể đưa ra đánh giá về số lượng sản phẩm khuếch đại DNA đích có mặt ở mỗi chu kỳ.(Các tín hiệu huỳnh quang thường được sử dụng gồm: SYBR Green, đầu dò Taqman, …)

Nghiên cứu ứng dụng phương pháp RT-PCR (Reverse transcription - Polymerase Chain Reaction) là phương pháp được sử dụng để phát hiện vật liệu di truyền của virus trong đa dạng loại mẫu Nhằm phát hiện được sự tồn tại của virus H5N1 trước khi chúng gây ra triệu chứng rõ ràng cho vật nuôi Bên cạnh đó, phản ứng RT-PCR phát hiện virus cúm gia cầm trên cơ sở phát hiện các đoạn gen H5 và N1

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu bệnh tích ở các chuồng trại gia súc gia cầm, ổ dịch được nghi vấn mang mầm

bệnh cúm H5N1 do virus cúm A/H5N1 gây ra 3.2 Mục đích

Phát hiện thể virus cúm A/H5N1 trên gia cầm bằng kỹ thuật RT-PCR

3.3 Phương pháp tiến hành

3.3.1 Lấy mẫu bệnh phẩm

Mẫu xét nghiệm kháng nguyên: lấy 3 gam đến 5 gam bệnh phẩm (não, phổi, khí quản, lách, ruột ) của gia cầm bị bệnh Trong trường hợp gia cầm còn sống, sử dụng tăm bông để ngoáy dịch ổ nhớp (swab), họng hoặc lấy phân tươi sau đó cho vào dung dịch PBS, pH 7,2 đến 7,4, có bổ sung dung dịch kháng sinh theo tỉ lệ 1:10

Chỉ thực hiện đối với gia cầm chưa tiêm vắc xin cúm gia cầm: lấy máu của gia cầm nghi mắc cúm bằng cách sử dụng xy lanh 5 ml để lấy 1 ml máu, rút cán xy lanh tới mức cao nhất để tạo nhiều khoảng trống bên trong, đặt xy lanh nằm nghiêng 5° ở nhiệt độ 20 đến 30°C trong thời gian 30 min để máu tự đông lại và tiết ra huyết thanh Chắt huyết thanh sang ống 1,5 ml mới để dùng cho xét nghiệm.Các mẫu phải được bảo quản lạnh từ 2°C đến 8°C và vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ

3.3.2 Phát hiện kháng nguyên

3.3.2.1 Xử lý mẫu bệnh phẩm (não, phổi, khí quản, lách, ruột)

Nghiền 1 gam bệnh phẩm bằng cối chày sứ với dung dịch PBS pH 7,2 theo tỉ lệ 1:10 thành huyễn dịch 10%

Bổ sung 1/10 lượng kháng sinh đậm đặc, chuyển sang ống ly tâm Ly tâm ở tốc độ 8000 r/min trong 15s

Thu dịch bệnh phẩm phía trên vào 2 ống 1,5 ml Một ống dùng cho các xét nghiệm Realtime RT-PCR (rRT-PCR), phân lập virus trên tế bào, phân lập trên trứng, ống cò lại dùng làm mẫu lưu bảo quản ở nhiệt độ -80°C

3.3.2.2 Dịch ngoáy ổ nhớp, họng, khí quản, phân tươi

Lắc ống chứa tăm bông dịch ngoáy bằng máy lắc trong 15s, ly tâm ống ở tốc độ 8000r/min trong 15s

Dùng pipet hút dịch trong ống chuyển sang 2 ống 1,5 ml Một ống dùng cho các xét nghiệm Realtime RT-PCR, phân lập virus trên tế bào hoặc phân lập trên trứng, ống còn lại dùng làm mẫu lưu bảo quản ở nhiệt độ -80°C

3.3.3 Phương pháp RT-PCR 3.3.3.1 Chiết tách RNA

Sau khi xử lý mẫu, tiến hành chiết tách ARN đối với các dịch bệnh phẩm bằng kit thương mại RNA tổng số được tách bằng cách sử dụng tất cả biện pháp phòng ngừa an toàn cần thiết ARN thu được sau quá trình chiết tách được hòa tan trong 20 μL nước không có RNase

3.3.3.2.Tiến hành phản ứng

Sử dụng 2 µl RNA được sử dụng trong 25 µL hỗn hợp phản ứng bằng cách sử dụng Hệ thống sao chép ngược một bước (RT)-PCR với các loại mồi đặc hiệu H5N1

như sau:

Primer xuôi: 5'-ACTATGAAGAATTGAAACACCT-3' Primer ngược: 5'-GCAATGAAATTTCCATTACTCTC-3'

Chương trình PCR được cài đặt là: 60°C trong 1 phút, 42°C trong 10 phút, 50°C trong 30 phút và 94°C trong 15 phút Sau đó là 35 chu kỳ 94°C trong 30 giây, 50°C trong 30 giây và 72°C trong 1 phút và cuối cùng là 72°C trong 10 phút Kích thước của PCR này, sản phẩm có khối lượng 456bp và được phân giải trong agarose 1,2% gel Sản phẩm PCR được giải trình tự trực tiếp để xác nhận nhận diện sản phẩm

3.3.3.3 Điện di sản phẩm RT-PCR

Pha bột agarose với dung dịch 1xTAE , rồi đun nóng trong lò vi sóng cho đến khi tan hoàn toàn Khi hỗn hợp nguội bớt (khoảng 50°C đến 60°C), cho tiếp tidi bromua Sau đó đổ vào khay và cắm lược Để gel cứng lại trong khoảng 1 giờ, rồi rút lược ra Đổ đầy dung dịch 1xTAE vào bể điện di, đặt khay gel vào vị trí trong bể điện di Pha loading dye với 100 bp ladder rồi đưa vào giếng đầu tiên của miếng gel Pha loading

dye với mẫu (đối chứng âm và dương), đưa vào các giếng còn lại của miếng gel Điện di gel ở 80V đến 100V trong 30 phút đến 40 phút Sau khi điện di xong, đặt gel đã điện di vào máy chiếu UV có bước sóng 590 nm để đọc kết quả

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Kết quả điện di sản phẩm của phản ứng RT-PCR phát hiện các gen M, H5 hoặc N1 được đọc như sau: Phản ứng RT-PCR hiển thị vạch sản phẩm là phản ứng dương tính Phản ứng RT-PCR không hiển thị vạch sản phẩm như xác định ở trên là phản ứng âm tính

Mồi được thiết kế tại các vùng bảo tồn của virus Gen HA ít có khả năng bị ảnh hưởng bởi những thay đổi đột biến Điều này cho phép phát hiện phạm vi rộng của các chủng phân lập và các biến thể của phân nhóm H5N1 Hiệu suất của mồi lần đầu tiên được đánh giá trên nền gel các xét nghiệm sử dụng RNA phiên mã in vitro do T7 tạo ra Hệ thống phiên mã in vitro RiboMax Express Nồng độ RNA phiên mã tinh khiết là được đo bằng thuốc thử định lượng RNA RiboGreen và pha loãng nối tiếp các mẫu được phiên mã in vitro RNA đã được chuẩn bị nhân đôi RT-PCR một bước duy nhất được thực hiện bằng cách sử dụng 2 µl RNA trong máy luân nhiệt như được mô tả trong phương pháp và sản phẩm được phân tích trên gel agarose Các điều khiển không phải mẫu đã được bao gồm Các độ nhạy của xét nghiệm được tìm thấy là nhỏ hơn 1×103

sao chép và có thể phát hiện cụ thể RNA H5N1 4.2 Phát hiện cụ thể cúm gia cầm A/H5N1

Để thiết lập tính đặc hiệu của các xét nghiệm đối với phân nhóm H5N1 phát hiện, sau đó đã thử nghiệm mồi trên một số các chủng virus cúm A có nguồn gốc từ gia cầm (H3N8, H5N3, H7N3 và H9N2) Virus không gây cúm chẳng hạn như virus gây bệnh Newcastle (NDV) cũng được đưa vào làm điều khiển Có 13 bệnh về đường hô hấp khác đã được biết đến ở người do virus và vi khuẩn gây ra cũng bao gồm làm đối chứng Kết quả cho thấy việc phát hiện chỉ dành riêng cho H5N1 là số lượng gia cầm thực tế của con người, số ca nhiễm virus cúm cực kỳ thưa thớt trong thời gian qua nghiên cứu này bao gồm một nhóm các mẫu người đã biết không chứa virus H5N1 có nguồn gốc từ bệnh nhân biểu hiện các triệu chứng giống "cúm" rất hữu ích trong việc chứng minh tính chất không phản ứng chéo của các chất mồi này Trong một nỗ lực để điều tra sâu hơn về tính đặc hiệu của tập hợp mồi này, một bảng gồm các phân nhóm gia cầm và con người của virus Cúm A đã được sàng lọc Kết quả cho thấy rằng chỉ có phản ứng

chống lại các phân nhóm H5 với bộ mồi này và không có phản ứng với các phân nhóm khác Để đảm bảo rằng RNA từ những các phân nhóm không bị suy giảm, gen ma trận từ các mẫu này được khuếch đại song song Các mẫu được lấy từ các cơ quan tổng hợp đồng nhất và các mô, dịch niệu đạo, phết lỗ huyệt và khí quản Tất cả mang lại kết quả tích cực với khả năng phát hiện dương tính 100% đối với dịch bài niệu, 67% đối với phết lỗ huyệt và khí quản, và 86% đối với mô và cơ quan gộp đồng nhất xác minh độ nhạy của xét nghiệm RT-PCR này Nuôi cấy virus các phương pháp phân lập được thực hiện trên trứng được sử dụng làm xét nghiệm xác nhận cho tất cả các mẫu dương tính Sự khác biệt trong việc phát hiện này có thể là do sự khác nhau hiệu quả trong việc phục hồi RNA virus từ các mẫu khác nhau, với các phân đoạn dịch allantoic có hiệu quả cao nhất trong việc phục hồi và phát hiện RNA H5N1 trong số các mẫu Tối ưu hóa các giao thức trích xuất cũng có thể cải thiện khả năng phục hồi RNA từ các mô khác

Trong một nghiên cứu riêng biệt, độ nhạy của bộ mồi H5N1 này cũng được đánh giá dựa trên khuyến nghị hiện tại Bộ mồi H5 của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) Ba các chủng khác nhau đã được sử dụng – một RNA lưu trữ của con người (Con người 3028, từ đợt bùng phát ở Việt Nam năm 2004) và hai các chủng gia cầm mới được chiết xuất Một loạt pha loãng RNA đã được thực hiện trên ba mẫu từ 10-1 đến 10-8, và ở cả 3 chủng, bộ mồi H5N1 được mô tả ở đây mang lại hiệu suất tốt hơn từ 1 đến 2 nhật ký khi so với bộ mồi được khuyến nghị của WHO, chỉ ra rằng bộ mồi này hoạt động tốt và nhất quán Ngoài ra, năm mẫu dương tính từ Bộ mồi của Việt Nam sau đó cũng được xét nghiệm song song với bộ mồi H5 khác hiện nay và kết quả cho thấy H5N1 mồi được mô tả ở đây đã phát hiện được 5 trong số 5 chất mồi dương tính Mẫu H5N1 trong khi bộ mồi khác chỉ quản lý để phát hiện ba trong số năm, chỉ ra rằng Các mồi H5N1 được

mô tả ở đây nhạy hơn và có thể phát hiện các mẫu dương tính yếu với tải lượng virus thấp hơn

Hình 1 Phát hiện virus cúm gia cầm H5N1 bằng phương pháp RT-PCR

A Khuếch đại gen được phiên mã in vitro được pha loãng huyết thanh RNA chuỗi đơn (làn 2 đến 11) được đo bằng thuốc thử định lượng RNA RiboGreen và RNA H5N1 được chiết xuất từ dịch allantoic của trứng bị nhiễm bệnh (làn 19) Điều khiển không phải mẫu là (nước vô trùng) được minh họa là "NTC" Tải lượng virus được chỉ định theo số lượng bản sao cho mỗi phản ứng, (làn 2) 1 × 109 bản sao cho mỗi phản ứng, (làn 3) 1 × 108 bản sao cho mỗi phản ứng, (làn 4) 1 × 107 bản sao cho mỗi phản ứng, (làn 5) 1 × 106 bản sao cho mỗi phản ứng, (làn 6) 1 × 105 bản sao cho mỗi phản ứng, (làn 7) 1 × 104 bản sao cho mỗi phản ứng, (làn 8) 1 × 103

bản sao cho mỗi phản ứng, (làn 9) 1 × 102 bản sao cho mỗi phản ứng, (làn 10) 10 bản sao cho mỗi phản ứng và (làn 11) 1 sao chép cho mỗi phản ứng RNA virus được chiết xuất từ các mẫu người trước đây đã được xác nhận là virus hợp bào hô hấp (RSV) B (làn 12), virus sốt xuất huyết 1 (làn 13), virus sốt xuất huyết 2 (làn 14), virus sốt xuất huyết 3 (làn 15), virus sốt xuất huyết 4 (làn 16) và hội chứng hô hấp cấp tính nặng (SARS) (ngõ 17) cũng được xét nghiệm cho kết quả âm tính RNA chiết xuất từ cá thể khỏe mạnh (ngõ 18) cũng được thực hiện B Phát hiện cụ thể virus cúm gia cầm A H5N1 Các chủng tham chiếu của các phân nhóm khác nhau của virus cúm gia cầm A (làn 20 đến 24), bao gồm cả virus không phải cúm như virus gây bệnh Newcastle (NDV, làn 25) là chỉ ra Các chủng H5N1, H3N8, H9N2 và NDV được Viện Nghiên cứu Thú y phân lập từ mẫu thực địa, Malaysia, các chủng phân lập H5N3 và H7N5 được cung cấp bởi Khoa Bệnh lý Thú y của Đại học Tottori, Nhật Bản Tín hiệu tiêu cực từ các chủng phân lập không phải H5N1 và mẫu đối chứng không phải mẫu (nước) được hiển thị