cỏ thế hệ T1
Để xác định sự phân ly của gen chuyển trong thế hệ tiếp theo, chúng tôi đã tiến hành đánh giá khả năng nảy mầm của hạt chuyển gen T0 trên môi trƣờng nảy mầm có bổ sung glyphosate ở nồng độ 200 mg/l.
Lựa chọn ngẫu nhiên 30 hạt thuộc các dòng ngô đã đƣợc đánh giá là có sự hiện diện protein EPSPS bao gồm 4 dòng CM8.53E; VH1.112E; CH9.80E, CH9.35E. Những hạt đƣợc chọn đảm bảo có sức nảy mầm tốt. Khử trùng hạt bằng HgCl2 0,1% sau đó cho nảy mầm trên môi trƣờng MS có bổ sung 200 mg/l glyphosate. Kết quả thu đƣợc thể hiện trên bảng 3.9.
Bảng 3.9. Kết quả nảy mầm của hạt chuyển gen thế hệ T0
STT Tên dòng T0 Tổng số hạt thí nghiệm Số hạt nảy mầm Số hạt không nảy mầm 1 CM8.53Ea 35 26 9 2 VH1.112E 31 23 8 3 CH9.80E 32 29 3 4 CH9.35E 34 26 8 5 ĐC (CH9) 30 0 30
Kết quả thí nghiệm nảy mầm các hạt chuyển gen thế hệ T0 cho thấy, trong số 4 dòng chuyển gen có 3 dòng chuyển gen có sự phân ly gen tuân theo quy luật 3:1 của Menden và có 1 dòng có gen chuyển phân ly theo tỷ lệ 15:1. Theo quy luật phân ly của Menden, nếu gen chuyển nằm trên 1 NST thì khi các cây T0 tự thụ phấn, tỷ lệ phân ly của các cây mang gen/các cây không mang gen ở thế hệ T1 là 3:1, còn nếu gen nằm trên 2 NST sẽ cho tỷ lệ 15:1 tƣơng tự các trƣờng hợp gen nằm trên 3, 4, 5….NST sẽ là (3:1)n, trong đó n là số nhiễm sắc thể mang gen chuyển. Căn cứ vào quy luật này, dòng CH9.80E có gen chuyển nằm trên 2 NST khác nhau, còn dòng CM8.53Ea và VH1.112E có gen chuyển nằm trên 1 nhiễm sắc thể do đó sự phân ly ở thế hệ T1 theo tỷ lệ 3:1
Hình 3.13. Kết quả đánh giá khả năng nảy mầm hạt của các dòng ngô chuyển gen thế hệ T1 trên môi trƣờng chọn lọc.
Những hạt nảy mầm đƣợc trên môi trƣờng chọn lọc sẽ đƣợc chúng tôi chuyển ra trồng trên đất để đánh giá khả năng kháng thuốc trừ cỏ. Khi cây đƣợc 3 – 4 lá chúng tôi tiến hành phun thuốc trừ cỏ glyphosate. Kết quả cho thấy hầu hết các cây đều có khả năng kháng glyphosate, không có hiện tƣợng vàng lá và héo, trong khi các cây đối chứng (không chuyển gen) đều chết sau khi phun thuốc. Nhƣ vậy, bƣớc đầu chúng tôi có thể kết luận rằng gen EPSPS đã đƣợc chuyển thành công vào 3 dòng ngô.
Hình 3.14. Cây chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ thế hệ T1 dòng CH9 sau 3 lần phun
CHƢƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận
1. Biến nạp gen EPSPS vào 3 dòng ngô VH1, CM8, CH9 đã thu đƣợc 65/120 cây sống sót khi đƣa ra bầu đất trong đó có 19/37 cây thuộc dòng VH1; 28/51 cây thuộc dòng CM8; 18/32 cây thuộc dòng CH9. Các cây chuyển gen đều sinh trƣởng, phát triển tốt và có kiểu hình bình thƣờng so với cây đối chứng không đƣợc chuyển gen
2. Trong số 65 cây chuyển gen tái sinh sống sót của 3 dòng thu đƣợc 6 cây dòng CM8; 3 cây dòng VH1; 5 cây dòng CH9 cho kết quả dƣơng tính với PCR, trong đó có 2/6 cây dòng CM8, 1/3 cây dòng VH1, 2/5 cây dòng CH9 cho kết quả dƣơng tính với Southern blot. Kết quả đánh giá sự có mặt của protein thu đƣợc (4/6 dòng CM8; 3/3 dòng VH1; 3/5 dòng CH9 có mặt protein EPSPS.
3. Đánh giá khả năng kháng thuốc trừ cỏ glyphosate của 65 cây ở thế hệ T0 có 3/28 cây dòng CM8; 2/19 cây dòng VH1; 3/18 cây dòng CH9 sống sót sau 3 lần phun với nồng độ 200 mg/l
4. Kết quả đánh giá tỷ lệ nảy mầm của hạt các dòng ngô chuyển gen thế hệ T0 trên môi trƣờng MS bổ sung 200 mg/l glyphosate thu đƣợc: 3/4 dòng chuyển gen có sự phân ly của gen chuyển theo tỷ lệ 3:1 và 1 dòng phân ly theo tỷ lệ 15:1. Các cây nảy mầm từ hạt T0 đều sống sót sau 3 lần phun glyphosate
4.2 Kiến nghị
Cần tiếp tục nghiên cứu đánh giá sự ổn định của gen chuyển EPSPS trong các dòng ngô chuyển gen ở các thế hệ tiếp theo nhằm chọn tạo đƣợc các dòng ngô chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ ổn định làm nguồn vật liệu cho chọn tạo giống ngô.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Văn Đồng, Phạm Thị Lý Thu, Tạ Kim Nhung, Trịnh Thị Minh Thùy, Hà Văn Chiến, Lê Thanh Nga, Lê Thị Thu Về, Lê Thị Thu Hiền, Nông Văn Hải, Lê Huy Hàm (2010), “ Kết quả bƣớc đầu trong nghiên cứu chuyển gen kháng sâu cry1A(c) vào phôi non các dòng ngô mô hình”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 8(1), tr. 1-8
2. Nguyễn Văn Đồng, Phạm Thị Lý Thu, Lê Thị Mai Hƣơng, Phạm Thị Hƣơng, Lê Thị Thu Về, Nguyễn Chiến Hữu, Lê Huy Hàm (2013), “ Nghiên cứu biến nạp gen kháng hạn vào một số dòng ngô chọn lọc thông qua vi khuẩn
Agrobacterium”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, 2(41), tr. 61-67
3. Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh, Trần Duy Quý (2003), “Nghiên cứu cải tiến hiệu quả nuôi cấy bao phấn ngô bằng phƣơng pháp lai hữu tính”, Tạp chí Di truyền học và ứng dụng
4. Ngô Hữu Tình (2009), Chọn lọc và lai tạo giống ngô, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.
5. Phạm Thị Lý Thu, Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh (2003), “Đánh giá khả năng sinh trƣởng, phát triển và tái sinh cây từ phôi non hai dòng ngô nhập nội HR8, HR9 trong điều kiện Việt Nam”, Tạp chí nông nghiệp và PTNT, Số 9, tr. 726-729.
6. Phạm Thị Lý Thu, Phạm Minh Thợi, Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh (2003), “Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh sử dụng cho biến nạp gen ở ngô”,
Kỷ yếu hội nghị CNSH toàn quốc 2003, tr. 820-824.
7. Phạm Thị Lý Thu, Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh (2005), “Ảnh hƣởng của một số yếu tố đến hiệu quả chuyển gen ở ngô thông qua vi khuẩn
A.tumefaciens”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, Số 10, tr. 28-31.
8. Phạm Thị Lý Thu, Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh (2006), “Hoàn thiện quy trình chuyển gen ở ngô bằng súng bắn gen”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, Số 8, tr. 31-35
9. Phạm Thị Lý Thu (2007), Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh từ phôi non và xác định phương pháp chuyển gen thích hợp ở ngô, Luận án tiến sỹ sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Hà Nội.
10. Nguyễn Thị Khánh Vân, Lê Huy Hàm, Lƣu Mỹ Dung, Đỗ Năng Vịnh (2005), “Bƣớc đầu nghiên cứu nuôi cấy noãn ngô chƣa thụ tinh thông qua mô nuôi”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, Số 18, tr.20 – 22.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
11.Ahmadabadi M, Ruf S, Bock R (2007), “A leaf based regeneration and transformation system for maize (Zea mays L.)”, Transgenic Res, 16, pp. 437- 448.
12.Aldemita R.R., Hodges Thomas K. (1996), “Agrobacterium tumefaciens- mediated transformation of japonica and indica rice varieties”, Planta,
199, pp. 612-617.
13.Angenon G., and Van Montagu M. (1992), “Agrobacterium-mediated transformation and its application in plant molecular biology research and biotechnology”, Biotechnology and crop improvement in Asia, pp. 181-199.
14.Arencibia A.D., Carmona E.R.C., Tellez P., Chan M.T., Yu S.M., Trujillo L.E., Oramas P. (1998), “An efficient protocol for sugarcane (S. spp. L.) transformation mediated by A. tumefaciens”, Transgenic Research, 7(3), pp. 213-222.
15.Armstrong C.L., Rout J.R. (2001), “A novel Agrobacterium-mediated plant transformation method”, Int. Patent Publ. WO01/09302 A2.
16.Bajaj Y.P.S. (1994), Biotechnology in Maize improvement, Biotechnology in Agriculture and Forestry, 25, pp. 3-23.
17.Bettany A.J.E., Dalton S.J., Timms E., Manderyck B., Dhanoa M.S., Morris P. (2003), “A. tumefaciens-mediated transformation of F. arundinacea
(Schreb.) and L. muiltiflorum (Lam)”, Plant Cell Reports, 21, pp. 437-444 18.Chan MT, Chang HH, Ho SL, Tong WF, Yu SM (1993), “A.tumefaciens- mediated production of transgenic rice plants expressing a chimeric alpha- amylase promoter/betaglucuronidase gene”, Plant Mol Biol, 22, pp. 491- 506.
19.Cheng M., Hu T., Layton J., Liu C.N., Fry J.E., (2003), “Desiccation of plant tissues post-Agrobacterium infection enhances T-DNA delivery and increases stable transformation efficiency in wheat”, In Vitro Cell Dev Biol Plant, 39(6), pp. 595-604.
20.Cheng M, Lowe BA, Spencer TM, Ye X, Armstrong CL (2004), “Factors influencing Agrobacterium-mediated transformation of monocotyledonous species”, In Vitro Cellular & Developmental Biology Plant, 40(1), pp. 31- 45.
21.Coggins JR, Abell C, Evans LB, Frederickson M, Robinson DA, Roszak AW, Lapthorn AP (2003), Experiences with the shikimate-pathway enzymes as targets for rational drug design, Biochem Soc Trans, 31, pp. 548-552.
22.Darbani B, Farajma S, ToorchiM, Noeparvar S, StewartN,Mohammed S, Zakerbostanabad S (2008), “Plant transformation: needs and futurity of the transgenes”, Biotechnology, 7(3), pp. 403-412.
23.Doebley.J and H. H. Iltis (1980), Taxonomy of Zea (Gramineae). I. A subgeneric classification with key to taxa., Amer. J. Bot, 67(6), pp. 982-993 24.Eady, C.C., Weld, R.J., Lister, C.E. (2000), “A. tumefaciens-mediated
transformation and transgenic-plant regeneration of onion (Allium cepa L.)”,
Plant Cell Reports, 19, pp. 376-381
25.Enriquez-Obregon G.A., Vazquez-Padron R.I., Prieto-Samsonov D.L., de la Riva G.A., Selman-Housein G. (1998), “Herbicide-resistant sugarcane (S.
officinarum L.) plants by Agrobacterium-mediated transformation”, Planta, 206, pp. 20-27.
26.Eschenburg S, Healy ML, Priestman MA, Lushington GH, Schonbrunn E (2002), “How the mutation glycine96 to alanine confers glyphosate insensitivity to 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase from Escherichia coli”, Planta, 216(1), pp. 129-135.
27.Frame BR, Shou H, Chikwamba HRK, Zhang Z, Xiang C, Fonger TM Pegg SEK, Li B, Nettleton DS, Pei D, Wang K (2002), “Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of maize embryo using a standard binary vector system”, Plant Physiol, 129(1), pp. 13-22.
28.Ganapathi T.R., Higgs N.S., Balint-Kurti P.J., Arntzen C.J., May G.D., Van Eck J.M. (2001), “Agrobacterium-mediated transformation of embryogenic cell suspension of the banana cultivar Rasthali (AAB)”, Plant Cell Reports, 20, pp. 157-162.
29.Gordon-Kamm W., Dilkes B.P., Lowe K., Hoerster G., Sun X., Ross M., Church L., Bunde C., Farrell J., Maddock S., Snyder J., Sykes L., Li Z., Woo Y.M., Bidney D., Larkins B.A. (2002), “Stimulation of the cell cycle and maize transformation by disruption of the plant retinoblastoma pathway”, Proc Natl Acad Sci USA, 99, pp. 11975-11980.
30.Hensel G, Kastner C, Oleszczuk S, Riechen J, and Kumlehn J (2009),
A.tumefaciens-Mediated Gene Transfer to Cereal Crop Plants: Current Protocols for Barley,Wheat, Triticale, and Maize, International Journal of Plant Genomics Volume 2009, Article ID 835608.
31.Hiei Y, Komari T, Kubo T (1997), “Transformation of rice mediated by
Agrobacterium tumefaciens”, Plant Mol Biol, 35, pp. 205-218.
32.Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T. & Kumashiro (1994), “Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA”. Plant J., 6, pp. 271- 282 .
33.Hooykaas P.J.J., Schilperoort R.A. (1992), “Agrobacterium and plant genetic engineering”, Plant Mol Biol, 19, pp.15-38.
34.Ishida Y, Saito H, Ohta S, Hiei Y, Komari T, Kumashiro T (1996), “High efficiency transformation of maize (Zea Mays L.) mediated by
Agrobacterium tumefaciens”, Nat Biotechnol, 14, pp. 745-750. 35.IPRI, 2003
36.James C (2007), “Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2007”, ISAAA Brief No. 36, ISAAA, pp. 3-4.
37.James C (2013), “Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2013”, ISAAA 6.
38.Kondo T., Hasegawa H., Suzuki M. (2000), “Transformation and regeneration of garlic (Allium sativum L.) by Agrobacterium-mediated gene transfer”,
Plant Cell Reports, 19, pp. 989-993.
39.Limanton-Grevet A., Jullien M. (2001), “Agrobacterium-mediated transformation of A. officinalis L.: molecular and genetic analysis of transgenic plants”, Mol Breed, 7, pp. 141-150.
40.Lucca P., Ye X., Potrykus I. (2001), “Effective selection and regeneration of transgenic rice plants with mannose as selective agent”, Mol Breed, 7, pp. 43-49.
41.Narasimhulu SB, Deng XB, Sarria R, and Gelvin SB (1996), “Early transcription of A.tumefaciens T-DNA genes in tobacco and maize”, Plant Cell, 8(5), pp. 873-886.
42.Negrotto D, Beer MJS, Wench AR, Hansen G (2000), “The use of phosphomannose-isomerase as a selectable marker to recover transgenic maize plants (Zea mays L.) via Agrobacterium transformation”, Plant Cell Rep, 19, pp. 798-803.
43.OECD (1999), Consensus document on general information concerning the genes and their enzymes that confer tolerance to glyphosate herbicide. ENV/JM/MONO(99)9, Series on Harmonization of Regulatory Oversight
in Biotechnology No.10, Organisation of Economic Co-operation and Development, Paris, France.
44.Priestman MA, Healy ML, Becker A, Alberg DG, Bartlett PA, Lushington GH, Schonbrunn E (2005), “Interaction of phosphonate analogues of the tetrahedral reaction intermediate with 5-enolpyruvylshikimate-3- phosphate synthase in atomic detail”, Biochemistry, pp. 44-324.
45.Repellin A, Boga M, Jauhar PP, Chibbar RN (2001), “Genetic enhancement of cereal crops by alien gene transfers: New challenges, Plant Cell Tissue and organ culture, 64, pp. 159-183.
46.Rout J.R.; Hironaka, C.M.; Conner, T.W.; DeBoer, D.L.; Duncan, D.R.; Fromm, M.E.; Armstrong, C.L. (1996), “Agrobacterium-mediated stable genetic transformation of suspension cells of corn (Zea mays L.)”, Annual Maize Genetics Conf., St.Charles, pp. 14-17.
47.Russell DA, Fromm ME (1997), “Tissue-specific expression in transgenic maize of four endosperm promoters from maize and rice”, Transgenic Res, 692, pp. 157-168.
48.Salas M.G., Park, S.H., Srivatanakul, M., Smith, R.H. (2001), “Temperature influence on stable T-DNA integration in plant cells”, Plant Cell Reports
20, pp. 701-705.
49.Saghai-Maroof MA, Soliman KM, Jorgensen RA, Allard RW (1984), “Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in bar-ley: mendelian inheritance, chromosomal location, and population dynamics”, Proc Natl Acad Sci USA, 81(24), pp. 8014-8018.
50.Sunikumar G., Rathore K.S. (2001), “Transgenic cotton: factors influencing
Agrobacterium-mediated transformation and regeneration”, Mol Breed, 8, pp. 37-52
51.Suzuki S., Nakano M. (2002), “Agrobacterium-mediated production of transgenic plants of Muscari armeniacum Leichtl. Ex Bak”, Plant Cell Reports, 20, pp. 835-841.
52.Tingay S., McElroy D., Kalla R., Fieg S., Wang M., Thornton S. & Brettell R., (1997), “A. tumefaciens-mediated barley transformation”, Plant J, 11, pp. 1369-1376.
53.Uze M., Wiinn J., Puonti-Kaerlas J., Potrykus I., Sautter C. (1997), “Plasmolysis of precultured immature embryos improves Agrobacterium- mediated gene transfer to rice (Oryza sativa L.)”, Plant Science, 130, pp. 87-95.
54.Urushibara S., Tozawa, Y., Kawagishi-Kobayashi M., Wakasa K. (2001), “Efficient transformation of suspension-cultured rice cells mediated by A. tumefaciens”, Breed Sci, 51, pp. 33-38.
55.Vladimir Sidorov, Larry Gilberston, Prince Addae (2006), “Agrobacterium mediate transformation of seedling – derived maize callus”, Plant Cell Rep, 25, pp. 320-328
56.Xueqing Huang & Zhiming Wei (2005), “Successful Agrobacterium- mediated genetic transformation of maize elite inbred lines”, Plant Cell Tissue and Organ Culture, 83, pp. 187-200
57.Ye, G.-N., Hajdukiewicz, P.T.J., Broyles, D., Rodriguez, D., Xu, C.W., Nehra, N., Staub, J.M. (2001), “Plastid-expressed 5-enolpyruvulshikimate- 3-phosphate synthase genes provide high level glyphosate tolerance in tobacco”, Plant J., 25, pp. 261-270
58.Zhang W., Subbarao S., Addae P., Shen A., Armstrong C., Peschke V., Gilbertson L. (2003), “Cre/lox mediated marker gene excision in transgenic maize (Zea mays L.) plants”, Theor Appl Genet, 107, pp. 1157-1168.
59. Zhao Z Y. T Cai, L Tagliani, M Miller, N Wang, H Pang, M Rudert, S Schroeder, D Hondred, J Seltzer, D Pierce (2000), “Agrobacterium- mediated sorghum transformation”, Plant Mol. Biol, 44, pp. 789-798 60.Zhao ZY, Gu W, Cai T, Tagliani LA, Hondred DA, Bond D, Krell S, Rudert
ML, Bruce WB, Pierce DA (1998), “Molecular analysis of T0 plants transformed by Agrobacterium and comparison of Agrobacterium-
mediated transformation with bombardment transformation in maize”,
Maize Genet Coop Newsl, 72, pp. 34-37
61.Zhao Z.Y., Gu W., Cai T., Tagliani L., Hondred D., Bond D., Schroeder S., Rudert M., Pierce D. (2001), “High throughput genetic transformation mediated by A. tumefaciens in maize”, Mol Breed, 8, pp. 323-333.
62.Wang M.B., Abbott D.C., Upadhyaya N.M., Jacobsen J.V., Waterhouse P.M. (2001), “A. tumefaciens-mediated transformation of an elite Australian barley cultivar with virus resistance and reporter genes”, Aust J Plant Physiol,
28, pp. 149-156.
63.Wilkes, H. G. (1967), Teosinte: the closet relative of maize, Bussey Inst., Harvard Univ., Cambridge, MA.
64.Wu H., McCormac A.C., Elliott, M.C., Chen, D.F. (1998), “Agrobacterium- mediated stable transformation of cell suspension cultures of barley”, Plant Cell Tissue and Organ Culture, 54, pp. 161-171.
Tài liệu website
65.FAOSTAT : www.faostat.fao.org 66.www.nongnghiep.vn
PHỤ LỤC Bảng 1. Thành phần môi trƣờng MS STT Thành phần Stock Hàm lƣợng (mg)/1lít môi trƣờng Lƣợng lấy (ml)/1lít môi trƣờng 1 KNO3 1MS 1900 20 2 NH4NO3 2MS 1650 20 3 KH2PO4 3MS 170 10 4 MgSO4.7H2O 4MS 370 10 5 CaCl2.2H2O 5MS 440 10 6 FeSO4.7H2O 6MS 27,8 10 7 Na2EDTA 37,3 8 H3BO3 7MS 6,2 10 9 MnSO4.4H2O 22,3 10 ZnSO4.7H2O 8,6 11 Na2MoO4.2H20 0,25 12 CuSO4.5H2O 0,025