Các thí nghiệm biến nạp gen kháng thuốc trừ cỏ EPSPS vào phôi hợp tử chƣa trƣởng thành thông qua vi khuẩn A. tumefaciens đƣợc tiến hành theo quy trình của Phạm Thị Lý Thu (2007) [9] và Zhao và cộng sự, 2001 [61] có cải tiến gồm các bƣớc nhƣ mô tả dƣới đây:
Tạo dịch huyền phù vi khuẩn
Cấy trải Agrobacterium cất giữ trong glycerol ở -80oC lên đĩa môi trƣờng môi trƣờng YEB đặc có bổ sung 50 mg/l kanamycin, nuôi ở 280C trong 2-3 ngày. Trƣớc khi biến nạp, hòa tan vi khuẩn trong môi trƣờng lây nhiễm tới OD550 0,3- 0,4; nuôi lắc 100 v/p trong thời gian 3 – 4 h, bổ sung 200 mg/l AS. Dịch huyền phù vi khuẩn này đƣợc sử dụng để lây nhiễm với phôi.
Khử trùng bắp
Bắp non đƣợc thu từ các cây ngô mẹ trồng trong nhà lƣới chống côn trùng. Bóc bỏ các lớp bao bi bên ngoài sau đó khử trùng bắp trong dung dịch nƣớc javen (NaClO) 30% với một vài giọt Tween-20 trong 20 phút sau đó rửa lại 5 lần bằng nƣớc cất khử trùng và để bắp dựng đứng trên đĩa Petri cỡ 10cm đã khử trùng (Hình 2.3)
Lây nhiễm vi khuẩn với phôi ngô non
Ngay sau khi khử trùng bắp, phôi non đƣợc tách trong điều kiện vô trùng. Phôi non sau đó đƣợc ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn khoảng 30 - 60 phút
Hình 2.3. Tách phôi từ bắp ngô dòng CM8 (Vụ Hè Thu, 8 ngày sau thụ phấn)
Giai đoạn đồng nuôi cấy
Phôi sau khi lây nhiễm với vi khuẩn đƣợc chuyển sang môi trƣờng đồng nuôi cấy (CCM), nuôi trong điều kiện tối, ở nhiệt độ 20oC, thời gian 3 ngày.
Nuôi phục hồi
Sau giai đoạn đồng nuôi cấy, chuyển phôi đã biến nạp từ môi trƣờng CCM sang môi trƣờng phục hồi (ReM) có chứa kháng sinh diệt khuẩn cefotaxime (250 mg/l), nuôi trong điều kiện tối, ở nhiệt độ 28oC, thời gian 7 ngày.
Chọn lọc mô sẹo chuyển gen
Mô sẹo tạo thành từ phôi non đã biến nạp trên môi trƣờng ReM đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng chọn lọc (EcM) (có bổ sung 100 mg/l Kanamycin), nuôi trong tối ở 28oC, thời gian 15 ngày.
Tạo chồi chuyển gen
Mô sẹo phôi hoá tạo thành trên môi trƣờng chọn lọc EcM đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng tái sinh chồi (SeM) để tái sinh chồi, nuôi ở điều kiện chiếu sáng ở 28oC, thời gian 15 - 20 ngày.
Tái sinh cây chuyển gen hoàn chỉnh
Chồi tái sinh trong môi trƣờng chọn lọc SeM khi đạt đƣợc chiều cao 2 – 3cm đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng tạo cây hoàn chỉnh RM, nuôi trong điều kiện chiếu sáng với chu kỳ chiếu sáng 16:8 h sáng: tối, ở nhiệt độ 25oC, thời gian 10-20 ngày.
Đưa cây ra đất
Cây tái sinh hoàn chỉnh sẽ đƣợc chuyển ra trồng trong túi bầu có chứa giá thể TN.1 (Viện Thổ Nhƣỡng Nông Hóa); sau khi cây xuất hiện lá mới thì chuyển sang trồng trên luống đất trong nhà lƣới cách ly côn trùng.
Bảng 2.1. Công thức môi trƣờng
Môi trƣờng Thành phần
YEB 10g/l peptone + 10 g/l yeast extract + 5g/l NaCl+ 12g/l agar; pH 7.0 IM - AS N6 (Chu & CS., 1975) + 2 mg/l glycine + 68,5 g/l sucrose + 36 g/l
glucose + 0,7 g/l L-proline + 1,5 mg/l 2,4D; pH 5,2; 200 mg/l AS. CCM N6 (Chu & CS., 1975) + 2 mg/l glycine + 30 g/l sucrose + 0,7 g/l L-
proline + 1,5 mg/l 2,4D; 6 g/l gellan-gum; pH 5,8; 200 mg/l AS; 0,85 mg/l AgNO3.
ReM N6 (Chu & CS., 1975) + 2 mg/l glycine + 30 g/l sucrose + 0,7 g/l L- proline + 0,5 g/l MES + 1,5 mg/l 2,4D; 6 g/l gellan-gum; pH 5,8; 0,85 mg/l AgNO3; 250 mg/l cefotaxim.
EcM N6 (Chu & CS., 1975) + 2 mg/l glycine + 30 g/l sucrose + 0,7 g/l L- proline + 0,5 g/l MES+ 1,5 mg/l 2,4D; 6 g/l gellan-gum; pH 5,8; 10 mg/l AgNO3; 250 mg/l cefotaxim; 100 mg/l kanamycine
SeM N6 (Chu & CS., 1975) + 2 mg/l glycine + 30 g/l sucrose + 0,7 g/l L- proline + 0,5 g/l MES; 6 g/l gellan-gum; pH 5,8; 1 mg/l BAP; 0,85 mg/l AgNO3; 250 mg/l cefotaxim; 100 mg/l kanamycine
RM MS (Murashige & Skoog, 1962) + 60 g/l sucrose + 100 mg/l myo- inositol; 9 g/l agar; pH 5,8