Chuyển gen vào cây ngô thông qua vi khuẩn Agrobacterium cho đến nay đã áp dụng đƣợc đối với một số dòng/giống có khả năng tái sinh in vitro tốt. Đối với cây ngô, phôi hợp tử chƣa trƣởng thành (phôi non) là nguồn vật liệu thích hợp nhất cho chuyển gen bằng cả phƣơng pháp bắn gen và thông qua vi khuẩn
Agrobacterium. Tuy nhiên, sử dụng mô đích là phôi non thì quá trình biến nạp sẽ chịu ảnh hƣởng nhiều bởi các yếu tố môi trƣờng. Đó là, sự sinh trƣởng của cây ngô mẹ cho vật liệu phôi trong các thời vụ trồng khác nhau trong năm sẽ ảnh hƣởng đến chất lƣợng phôi. Trong nghiên cứu đánh giá về những nhân tố quan trọng ảnh hƣởng đến hiệu quả chuyển gen, tác giả Phạm Thị Lý Thu đã chỉ ra kích thƣớc phôi ngô phù hợp cho thí nghiệm chuyển gen là từ 1,0 – 1,2 mm (Phạm Thị Lý Thu, 2007) [9]. Trên thực tế, xác định thời gian sau thụ phấn để thu đƣợc kích thƣớc phôi phù hợp cho các thí nghiệm biến nạp gen phụ thuộc vào hai yếu tố giống ngô và thời vụ trồng. Chúng tôi đã tiến hành trồng các dòng ngô thí nghiệm trong vụ Đông xuân (11/2012- 2/2013) và vụ hè thu (8/2013 – 10/2013) tại nhà lƣới cách ly côn trùng ở Văn Giang, Hƣng Yên. Kết quả theo dõi và kiểm tra mẫu tại nhà lƣới cho thấy kích thƣớc phôi tách từ các bắp ngô sau khi thụ phấn trong hai vụ trồng rất khác biệt. Hơn nữa, giữa các dòng ngô khác nhau kích thƣớc phôi cũng khác nhau với các bắp cùng thụ phấn tại một thời điểm. Để đạt đƣợc kích thƣớc phôi 1,0 – 1,2 mm làm vật liệu cho chuyển gen, bắp của các dòng ngô thí nghiệm trồng trong vụ Hè Thu sẽ đƣợc thu vào thời điểm 8 – 12 ngày và trong vụ Đông Xuân là 12 – 15 ngày sau thụ phấn. Kết quả biến nạp gen EPSPS vào 3 dòng ngô CM8, VH1, CH9 ở hai vụ trồng Hè Thu và Đông Xuân đƣợc đánh giá thông qua các thí nghiệm dƣới đây:
a, Vụ Đông Xuân 2012 – 2013
Trong vụ Đông Xuân 2012 – 2013, chúng tôi thực hiện 9 thí nghiệm chuyển gen
EPSPS vào 2 dòng ngô chọn lọc (VH1, CM8) và 1 dòng ngô lai CH9 (dòng lai F1 giữa dòng ngô chọn lọc CM8 với dòng mô hình HR9). Kết quả thí nghiệm đƣợc trình bày tại bảng 3.1
Bảng 3.1. Kết quả biến nạp gen EPSPS vào các dòng ngô vụ Đông Xuân TT Dòng Số lƣợng mẫu TL tạo mô sẹo TL tái sinh chồi Số cây ra đất Số cây sống sót
CCM REM ECM SEM RM
1 VH1 1467 1211 635 396 65 52,44 62,36 23 11 2 CM8 1378 1059 656 523 82 61,95 79,73 38 19 3 CH9 1152 810 404 136 42 49,88 33,66 12 5
Tổng số 3997 3080 1695 1055 189 73 35
Tổng số 9 thí nghiệm với 3997 phôi của 3 dòng ngô đã đƣợc sử dụng làm vật liệu biến nạp. Kết quả thu đƣợc 73 cây đƣợc đƣa ra đất, trong số đó chỉ có 35 cây sống sót
Kết quả thí nghiệm cho thấy các dòng ngô cho hiệu quả tiếp nhận gen rất khác nhau. Khả năng tiếp nhận gen ngoại lai của các dòng ngô thí nghiệm đƣợc biểu hiện thông qua tỉ lệ tạo mô sẹo phôi hóa trên môi trƣờng chọn lọc của phôi non sau chuyển gen. Trong 3 dòng ngô nghiên cứu cho thấy dòng ngô CM8 có tỉ lệ tạo mô sẹo (61,95%) cao hơn so với hai dòng VH1 và CH9. Dòng CH9 cho tỉ lệ tạo mô sẹo thấp nhất 49,88%
Xét về tỷ lệ tái sinh chồi của 3 dòng ngô chuyển gen cho thấy: dòng ngô CM8 cho tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất đạt 79,73%. Dòng CH9 có tỷ lệ tạo mô sẹo thấp nhất cũng cho tỷ lệ tái sinh chồi thấp nhất đạt 33,66%, trong khi đó dòng VH1 đạt 62,36%
Đánh giá khả năng sống sót của cây chuyển gen tái sinh khi đƣa ra bầu đất, chúng tôi đã nhận đƣợc số cây chuyển gen tái sinh nhiều nhất (19 cây) ở dòng CM8 và ít nhất (5 cây) ở dòng CH9. Trong khi đó, dòng VH1 thu đƣợc 11 cây. Các cây tái sinh của 3 dòng ngô đƣợc trồng trong nhà lƣới, hầu hết các cây ngô đều có kiểu hình bình thƣờng so với cây đối chứng không chuyển gen.
b, Vụ Hè Thu năm 2013
Trong vụ Hè Thu năm 2013, chúng tôi thực hiện 6 thí nghiệm chuyển gen
EPSPS vào 3 dòng ngô chọn lọc (VH1, CM8, CH9). Kết quả thí nghiệm đƣợc trình bày tại bảng 3.2
Bảng 3.2. Kết quả biến nạp gen EPSPS vào các dòng ngô vụ Hè Thu TT Dòng Số lƣợng mẫu TL tạo mô sẹo TL tái sinh chồi Số cây ra đất Số cây sống sót
CCM REM ECM SEM RM
1 VH1 1032 758 344 135 16 45,38 39,24 14 8 2 CM8 548 396 168 83 15 42,42 49,40 13 9 3 CH9 1330 1084 631 354 21 58,21 56,10 20 13
Tổng số 2910 2166 1143 572 52 54 30
Vụ Hè Thu, chúng tôi đã biến nạp 2910 phôi của 3 dòng ngô, kết quả thu đƣợc 30 cây sống sót khi đƣa ra bầu đất. Kết quả thí nghiệm cũng cho thấy trong số 3 dòng ngô nghiên cứu, dòng CH9 tỏ ra ƣu thế hơn so với hai dòng VH1 và CM8 về tỷ lệ tạo mô sẹo cũng nhƣ tỷ lệ tái sinh chồi chuyển gen. Dòng VH1 cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao hơn so với dòng CM8 nhƣng tỷ lệ tái sinh chồi lại thấp hơn.
So sánh số liệu trên bảng 3.1 và bảng 3.2 cho thấy: tỷ lệ mẫu phục hồi, tỷ lệ tạo mô sẹo, tỷ lệ tái sinh chồi và của 3 dòng ngô ở hai vụ Đông Xuân và Hè Thu là khác nhau: 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 TL mẫu phục hồi TL tạo mô sẹo TL tái sinh chồi Số cây ra đất Số cây sống sót VH1 CM8 CH9
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 TL mẫu phục hồi TL tạo mô sẹo TL tái sinh chồi Ra đất Số cây sống sót VH1 CM8 CH9
Hình 3.2. Kết quả biến nạp gen EPSPS vào 3 dòng ngô vụ Hè Thu
Tỷ lệ mẫu phục hồi đƣợc đánh giá bằng số phôi phát triển trên môi trƣờng phục hồi so với tổng số phôi biến nạp. So sánh về tỷ lệ mẫu phục hồi của 3 dòng ngô trong hai vụ, chúng tôi nhận thấy khả năng phục hồi của phôi sau lây nhiễm dòng CH9 thấp hơn hơn so với hai dòng VH1 và CM8 trong vụ Đông Xuân. Ngƣợc lại, trong vụ Hè Thu, khả năng phục hồi của mẫu dòng CH9 tốt hơn so với hai dòng còn lại. Trong vụ hè thu nhiệt độ không khí thƣờng biến động lớn, có nhiều ngày nhiệt độ tăng cao tới 38 – 40oC. Nhiệt độ cao ảnh hƣởng rất lớn tới quá trình sinh trƣởng của hạt phấn, của phôi hợp tử, có thể dẫn tới hạt phấn bất thụ và bắp sau khi thụ phấn không tạo hạt. Tuy nhiên, trong thời tiết nhiệt độ cao nhƣ vậy, các dòng lai thể hiện ƣu điểm vƣợt trội hơn so với các dòng ngô thuần. Vì thế, đây có thể là nguyên nhân dẫn đến trong vụ Hè Thu, sức sống của phôi dòng CH9 tốt hơn so với vụ Đông Xuân.
Dựa trên so sánh về tỷ lệ tạo mô sẹo và tỷ lệ tái sinh chồi, kết quả chứng minh khả năng tiếp nhận gen của 3 dòng ngô phụ thuộc rất lớn vào thời gian thu mẫu biến nạp và phụ thuộc vào kiểu gen (dòng/giống). Vụ Đông Xuân là mùa vụ thích hợp cho thí nghiệm biến nạp gen vào dòng ngô chọn lọc và vụ Hè Thu thích hợp đối với dòng ngô lai. Kết quả này cũng phù hợp với các kết quả nghiên cứu trƣớc của tác giả Nguyễn Văn Đồng và cộng sự (2010) [1]
Đồng nuôi cấy phôi dòng VH1- Agrobacterium
Nuôi cấy phục hồi dòng VH1
Tạo mô sẹo dòng VH1 trên môi trƣờng chọn lọc
Tái sinh chồi trên môi trƣờng chọn lọc
Tái sinh cây hoàn chỉnh trên môi trƣờng chọn lọc
Chuyển cây ra bầu đất
Cây dòng VH1 trong nhà lƣới cách ly côn trùng
Giai đoạn trổ cờ Bắp dòng VH1 chuyển gen