kiện nhà lƣới
Hoạt tính chức năng của gen EPSPS trong tất cả các cây chuyển gen đƣợc kiểm tra bằng việc đánh giá tác động thuốc trừ cỏ glyphosate lên các cây chuyển gen. Cơ chế hoạt động của protein CP4 EPSPS đƣợc mô tả nhƣ sau: Ở cây ngô thông thƣờng, khi phun thuốc trừ cỏ glyphosate, chất glyphosate sẽ gây chết cây ngô thông qua việc ức chế hoạt động của enzyme EPSPS nội sinh. Kết quả là cây ngô không có khả năng tổng hợp những hợp chất thơm cần thiết và do đó các quá trình sinh tổng hợp các auxins, các hợp chất kháng bệnh, phytoalexins, axit folic, tiền chất của lignin, flavonoids, plastoquinone, và hàng loạt các hợp chất phenol và alkaloid khác đều bị kìm hãm
Ngƣợc lại, khi phun thuốc glyphosate lên cây ngô mang gen EPSPS đƣợc tạo ra từ thí nghiệm chuyển gen, thì những cây chuyển gen mang gen EPSPS có đặc tính chống chịu với glyphosate trong thành phần thuốc trừ cỏ, nên quá trình trao đổi chất và sinh tổng hợp các axit amin thơm và các hợp chất cần thiết khác diễn ra bình thƣờng [43]
Dựa trên cơ chế tác động của enzyme EPSPS, chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ glyphosate đối với các cây chuyển gen thuộc 3 dòng VH1, CM8, CH9. Trƣớc hết, chúng tôi sử dụng phƣơng pháp nhuộm lá để chọn đƣợc nồng độ glyphosate phù hợp nhất nhƣ đã miêu tả trong phần vật liệu và phƣơng pháp. Mức độ biểu hiện của lá sau khi bôi glyphosate ở nồng độ khác nhau sau 6 – 10 ngày đƣợc chúng tôi ghi lại trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Khảo sát nồng độ glyphosate đối với các cây chuyển gen
Nồng độ glyphosate 200 mg/l 400 mg/l 600 mg/l 200 mg/l
Lá của cây đối chứng + + + +
Lá của cây chuyển gen - - + +
Ghi chú: (+) Vết bôi trên lá ngả màu vàng
Kết quả trên bảng 3.3 cho thấy: Trong khoảng thời gian từ 6 – 10 ngày, trên lá của cây đối chứng, vết bôi đã ngả sang màu vàng ở nồng độ glyphosate 200 mg/l. Trong khi đó, lá của cây chuyển gen có biểu hiện ngả vàng tại vị trí vết bôi glyphosate có nồng độ 600 mg/l. Ở nồng độ 200 – 400 mg/l lá của cây mang gen vẫn còn màu xanh. Do đó, chúng tôi sử dụng nồng độ glyphosate 200 mg/l là nồng độ phù hợp cho đánh giá khả năng kháng thuốc trừ cỏ glyphosate của các dòng ngô chuyển gen EPSPS.
Lá cây chuyển gen sau khi bôi thuốc trừ cỏ glyphosate ở các nồng độ 200 mg/l (số 1),
400 mg/l (số 2), 600 mg/l (số 3) và 1200 mg/l (số 4).
Lá cây đối chứng sau khi bôi thuốc trừ cỏ glyphosate ở các nồng độ 200 mg/l (số 1), 400 mg/l (số 2), 600 mg/l (số 3) và 1200
mg/l (số 4).
Hình 3.4. Khảo sát nồng độ glyphosate xử lí trên bề mặt lá ngô chuyển gen và mẫu đối chứng (lá cây ngô không chuyển gen)
3.3. Kết quả phân tích PCR sự có mặt của gen kháng thuốc trừ cỏ EPSPS của các dòng ngô chuyển gen thế hệ T0
Tách chiết ADN tổng số từ lá của các dòng ngô chuyển gen EPSPS thế hệ T0
Chúng tôi đã tiến hành tách chiết 65 mẫu ADN tổng số từ lá của các dòng ngô chuyển gen EPSPS thế hệ T0 nhận đƣợc từ các thí nghiệm biến nạp vụ Đông Xuân và Hè Thu. Mẫu ADN sau khi tách chiết bằng phƣơng pháp CTAB [49] có cải tiến đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 0,8% và đo bằng máy Nanodrop để đánh giá mức độ tinh sạch, nguyên vẹn và nồng độ của ADN
Hình 3.5. Kết quả điện di kiểm tra mẫu ADN tổng số trên gel agarose 0,8% Kết quả điện di cho thấy: Chất lƣợng ADN tổng số tách từ các mẫu tƣơng đối tốt. ADN đạt độ tinh sạch và không bị đứt gãy. Mặt khác không thấy xuất hiện các vệt sáng ARN phía dƣới, điều đó chứng tỏ ARN đã đƣợc loại bỏ hoàn toàn khỏi dịch chiết ADN. Dựa trên giá trị OD260 đo đƣợc cho thấy hàm lƣợng ADN thu đƣợc khá cao. Sản phẩm ADN tổng số của các dòng ngô chuyển gen đƣợc chúng tôi sử dụng để tiến hành các phân tích tiếp theo.
Bảng 3.4. Hàm lƣợng ADN của các cây chuyển gen
STT Tên mẫu Hàm lƣợng ADN Tỉ lệ 260/280 Tỉ lệ 260/230
1 VH1.2E 4106,8 2,02 2,27 2 VH1.30Ea 5710,9 1,95 2,14 s VH1.25E 6196,4 1,93 2,08 4 VH1.30Eb 2673,6 2,01 2,28 5 VH1.40E 3600,1 2,05 2,24 6 VH1.65E 3528,8 2,11 2,51 7 VH1.72E 4038,9 2,02 2,22 8 VH1 2593,6 1,95 2,12 9 CM8.6E 4970,4 2,00 2,19 10 CM8.12E 3446,9 2,02 2,28 11 CM8.53Ea 2418,3 1,79 1,91 12 CM8.53Eb 8920,7 1,98 2,25
STT Tên mẫu Hàm lƣợng ADN Tỉ lệ 260/280 Tỉ lệ 260/230 13 CM8.55E 5796,7 1,99 2,26 14 CM8.77E 9374,5 1,97 2,24 15 CM8.79E 8179,5 1,85 1,95 16 CH9.35E 8501,9 1,99 2,27 17 CH9.46E 8641,3 1,84 2,02 18 CH9.80E 3615,2 1,93 2,13 19 CH9.82E 5001,5 1,93 2,17 20 CH9.83E 9468,1 1,98 2,24 21 CH9.124E 5470,3 1,85 2,04
Kết quả phân tích PCR các cây chuyển gen EPSPS thế hệ T0
Trong quá trình tạo dòng ngô kháng thuốc trừ cỏ bằng phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium, sự có mặt của gen chuyển EPSPS trong các cây chuyển gen đƣợc chúng tôi đánh giá thông qua kỹ thuật PCR. Tổng số 65 mẫu ADN của các cây chuyển gen tái sinh đƣợc sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi CP4 – EPSPS F; CP4 – EPSPS R có thành phần và chu trình đã đƣợc miêu tả trong phần vật liệu và phƣơng pháp. Chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
Bảng 3.5.Kết quả phân tích PCR gen kháng thuốc trừ cỏ EPSPS trong các dòng ngô chuyển gen
Gen chuyển Dòng ngô thế hệ T0 Tổng số cây phân tích Số cây dƣơng tính với PCR
EPSPS
CM8 28 6
VH1 19 3
CH9 18 5
Tổng 65 14
Kết quả phân tích PCR cho thấy, trong tổng số 65 mẫu ADN của những cây chuyển gen tái sinh sống sót, có 14 cây cho kết quả dƣơng tính với kích thƣớc băng ADN thu đƣợc 644 bp, phù hợp với gen EPSPS.
Hình 3.6. Kết quả phân tích PCR gen EPSPS ở các cây T0 của dòng CM8
Ghi chú: M. Marker 1 kb, P. plasmid pBI 121 mang gen EPSPS, CM8. Đối chứng âm (Cây không chuyển gen), 77E; 55E; 6E; 53Ea; 53Eb; 12E: Các cây dòng CM8 mang gen EPSPS;
Hình 3.7. Kết quả phân tích PCR gen EPSPS ở các cây T0 của dòng CH9
Ghi chú: M. Marker 1 kb, P. plasmid pBI 121 mang gen EPSPS, CH9. Đối chứng âm (Cây không chuyển gen), 35E; 46E; 82E; 83E: 80E: các cây dòng CH9 mang gen EPSPS; 124E; Cây dòng CH9 không mang gen chuyển
Hình 3.8. Kết quả phân tích PCR gen EPSPS các cây T0 dòng VH1
Ghi chú: M. Marker 1 kb, P. plasmid pBI 121 mang gen EPSPS, VH1. Đối chứng âm (Cây không chuyển gen); 2E, 112E, 30Eb: các cây chuyển gen dòng VH1 mang gen EPSPS; 65E, 30Ea, 72E, 38E, 94E, 93E, 95E: các cây chuyển gen dòng VH1 không mang gen EPSPS
Trong số 65 cây chuyển gen tái sinh sống sót khi đƣa ra bầu đất chỉ có 37 cây có khả năng hữu thụ. Dòng CM8 có 28 cây sống sót, có 6 cây mang gen
EPSPS, tuy nhiên chỉ có 2 cây kết hạt. Dòng VH1 với tổng số 19 cây sống sót, có 3 cây dƣơng tính với gen EPSPS, 2 cây có khả năng hữu thụ. Dòng CH9 có tổng số 18 cây sống sót, có 5 cây có mặt gen EPSPS, nhƣng cũng chỉ có 3 cây tạo hạt. Dựa trên kết quả chuyển gen và phân tích PCR chúng tôi thực hiện đánh giá hiệu quả chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Kết quả đƣợc thể hiện trên bảng 3.6
Bảng 3.6. Hiệu quả chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Dòng ngô Đồng nuôi cấy (số phôi) (A) Số callus tạo thành trong môi trƣờng chọn lọc (kháng Kanamycin) Số chồi tái sinh trong môi trƣờng chọn lọc Số cây tái sinh hoàn chỉnh Số cây dƣơng tính với PCR (B) Tần số chuyển gen (%) (B/A) CM8 1926 606 81 28 6 0,31 VH1 2499 531 97 19 3 0,12 CH9 2482 490 63 18 5 0,20 Tổng số 6907 1627 251 65 14
Trong số 65 cây chuyển gen tái sinh hoàn chỉnh từ callus tạo thành trong môi trƣờng chọn lọc (có bổ sung kanamycin) của 3 dòng ngô đƣợc kiểm tra bằng PCR thì có 14 cây mang gen chuyển EPSPS. Số cây tái sinh từ callus thu đƣợc khá cao nhƣng chỉ có 14/65 cây mang gen EPSPS, nhƣ vậy trong các thí nghiệm biến nạp có hiện tƣợng cây sống sót trong môi trƣờng chọn lọc nhƣng lại không mang gen chuyển nạp. Nguyên nhân của hiện tƣợng này có thể là các cây âm tính này đƣợc tạo ra từ callus không mang gen sống sót trên môi trƣờng chọn lọc hoặc gen đã đƣợc chuyển vào nhƣng không kết hợp ổn định vào hệ gen của cây ngô.
Trong số 3 dòng ngô chuyển gen (CM8, VH1, CH9), dòng CM8 có tần số chuyển gen cao nhất 0,31%, trong khi đó dòng VH1 có tần số chuyển gen thấp nhất (0,12%). Nghiên cứu của Frame và cộng sự (2002) [27] đã thực hiện chuyển gen vào dòng ngô HiII thông qua vi khuẩn Agrobacterium, hiệu quả chuyển gen thu đƣợc rất cao 5,5%. Nhƣ vậy, hiệu quả chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium ngoài các yếu tố ảnh hƣởng khác còn phụ thuộc rất lớn vào kiểu gen thực vật