2.1.1. Mẫu nghiên cứu
Mẫu nghiên cứu Cỏ seo gà gồm:
Mẫu cây thu hái mang bộ phận sinh sản để giám định tên khoa học. Mẫu cây tươi mang bộ phận sinh sản để làm tiêu bản mẫu khô.
Mẫu cây tươi mang bộ phận sinh sản, lá để làm tiêu bản vi học cấu tạo giải phẫu.
Mẫu cây (toàn cây bao gồm: thân rễ và lá) được thu hái, phơi hoặc sấy khô, đóng gói bảo quản nơi khô ráo để làm thực nghiệm.
Nơi thu hái: Ba Vì-Hà Nội.
Thời điểm thu hái mẫu: Tháng 10/2012.
2.1.2. Các dòng tế bào thí nghiệm.
Các dòng tế bào ung thư: tế bào ung thư cổ tử cung (HeLa), tế bào ung thư vú (MCF7), tế bào ung thư dạ dày (N87).
2.1.3. Thuốc thử, dung môi, hoá chất
Các thuốc thử, dung môi, hoá chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV.
Các dung môi chiết xuất : n-hexan; cloroform; ethyl acetat; nước cất…
Các dung môi chạy sắc ký : methanol, ethyl acetat, nước cất , acid formic…
Các thuốc thử định tính.
Các môi trường nuôi cấy tế bào ung thư: các dòng tế bào được nuôi cấy trong môi trường DMEM hoặc RPMI có bổ sung 10% huyết thanh thai bò FBS và 1% kháng sinh penicillin/streptomycin.
Các hóa chất khác: bộ kit xác định lượng tế bào CellTiter 96 Non- Radioactive Cell Proliferation Assay, dung dịch MTS, dung dịch (PMS).
16
2.1.4. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu
Kính hiển vi Leica CME tại Bộ môn Dược liệu -Trường Đại học Dược Hà Nội.
Kính soi nổi Leica EZ4 tại Bộ môn Thực vật-Trường Đại học Dược Hà Nội.
Máy ảnh kĩ thuật số Canon Power shot S40
Máy cất quay chân không Kika (Đức).
Tủ sấy chân không Shellab 1430D-2E (Đức).
Máy xác định hàm ẩm Sartorius.
Bản mỏng tráng sẵn Silica gel GF254-Merck (Đức).
Máy đo phổ khối lượng (ESI-MS): LC/MS Single Quadrupole Agilent 1260 Series (USA), Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Bruker AM500 FT-NRM Spectrometer, Viện hóa học-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Máy đo điểm nóng chảy: Kofler micro hotstage, Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Tủ hút, buồng đếm tế bào, tủ ấm 5% CO2, máy đo quang ELISA.
Bình định mức, bình gạn, pipet, đĩa nuôi cấy 96 giếng, ống bảo quản mẫu, ống Falcon, ống ly tâm, các dụng cụ thí nghiệm...
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Mô tả đặc điểm thực vật 2.2.1. Mô tả đặc điểm thực vật
Phân tích hình thái thực vật:
Mô tả đặc điểm hình thái theo phương pháp ghi trong tài liệu [5]. Phân tích cây và chụp ảnh bằng máy ảnh.
Nghiên cứu đặc điểm vi học theo tài liệu: Thực tập thực vật và nhận biết cây thuốc [5]. Thực tập dược liệu-Phần vi học [4].
17
Kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hiển vi [16].
Quan sát cấu tạo vi phẫu lá, thân rễ; bột lá, bột thân rễ bằng kính hiển vi.
Chụp ảnh các đặc điểm vi học bằng máy ảnh.
Giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu:
Đối chiếu với mô tả trong tài liệu chuyên sâu về thực vật như:
Từ điển thực vật thông dụng [10].
Từ điển cây thuốc Việt Nam [9].
Cây cỏ Việt Nam [14].
Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam [15].
Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam [20].
So sánh đối chiếu với mẫu tiêu bản tại phòng tiêu bản mẫu khô - Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật.
2.2.2. Xác định thành phần hóa học
2.2.2.1. Định tính:
Định tính các nhóm chất thường gặp trong dược liệu bằng phản ứng hóa học [2], [3], [12].
Định tính cắn methanol bằng sắc ký lớp mỏng [7], [12], [17].
2.2.2.2. Chiết xuất:
Xác định độ ẩm: Lấy khoảng 2 g bột dược liệu để xác định độ ẩm. Bật máy đo độ ẩm, điều chỉnh nhiệt độ 1100C. Trải đều dược liệu lên đĩa cân, đậy đĩa cân và đợi máy tự động hiển thị kết quả. Tiến hành 3 lần cho 3 mẫu ở 3 vị trí khác nhau để lấy giá trị trung bình.
Chiết xuất bằng phương pháp ngâm ở nhiệt độ phòng [2], [6], [12]. Dược liệu đã nghiền nhỏ đến kích thước thích hợp (bột thô) cho vào bình kín ở nhiệt độ phòng với dung môi methanol 80%, sau khi ngâm 2 ngày, gạn, ép dịch chiết, lọc tạp chất. Bã thu được tiến hành ngâm lần 2, lần 3 tương tự lần 1.
18
Dịch chiết thu được đem cất thu hồi dung môi bằng máy cất quay chân không, thu được cắn.
Hiệu suất chiết được tính theo công thức:
1 100 x M b X
Trong đó: X: hiệu suất (%).
b: Khối lượng cắn (g).
M: Khối lượng dược liệu đem chiết (g).
x: Độ ẩm của dược liệu (%).
2.2.2.3. Phân lập
Phân lập các chất bằng sắc ký cột thông dụng [12].
Chuẩn bị
Chất hấp phụ: Silica gel hấp phụ pha thuận và pha đảo.
Cột sắc ký: cột sắc ký có kích thước dài 40 cm, đường kính 2,9 - 3,2 cm.
Dung môi rửa giải là hỗn hợp được pha từ các dung môi thường dùng như: n-hexan, cloroform, ethyl acetat, aceton, methanol và nước.
Tiến hành phân lập Chuẩn bị cột:
Cố định cột sắc ký trên giá đỡ, lót một lớp bông mỏng dưới đáy cột. Cân một lượng silica gel vừa đủ, phân tán trong hệ dung môi rửa giải thành một hỗn dịch đồng nhất và không có bọt khí. Mở khóa của cột, rót nhanh hỗn dịch silica gel vào cột để cho silica gel lắng tự nhiên. Bổ sung dung môi liên tục lên cột, chú ý không để cột bị khô hay làm xáo trộn lớp silica gel bề mặt. Sau khi dung môi chảy được 2 giờ thì bổ sung dung môi đến gần miệng cột, đậy nút mài và để yên 12 giờ rồi tiến hành đưa mẫu lên cột.
Nạp mẫu lên cột:
Hòa mẫu phân lập trong dung môi thích hợp. Trộn đều với 1 lượng vừa đủ silica gel, sấy khô rồi tán thành bột tơi xốp. Cho bột lên cột thật đều, rải
19
thành 1 lớp đều đặn trên mặt. Sau khi lớp bột mang mẫu ổn định, rắc thêm 1 lớp mỏng silica gel lên trên bề mặt để tránh tình trạng xáo động mặt cột khi cho dung môi rửa giải lên cột.
Rửa giải:
Phản hấp phụ bằng hệ dung môi thích hợp, kiểm soát tốc độ dòng chảy, hứng dịch rửa giải vào các bình nón hoặc ống nghiệm với thể tích thích hợp.
Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng, gộp những phân đoạn có thành phần tương tự nhau thành các phân đoạn mới.
Tinh chế các chất phân lập
Sử dụng phương pháp kết tinh lại hoặc rửa nhiểu lần bằng dung môi ít hòa tan các chất phân lập.
Kiểm tra độ tinh khiết của các chất phân lập
Độ tinh khiết của chất phân lập được kiểm tra bằng phương pháp SKLM. Mỗi chất phân lập được kiểm tra bằng nhiều hệ dung môi khác nhau.
2.2.2.4. Nhận dạng chất phân lập
Các chất phân lập được ở dạng tinh khiết (đã được kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM) được lấy mẫu để đo phổ khối, phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D-NMR) và hai chiều (2D-NMR). Sau đó, căn cứ vào các dữ liệu phổ thu được sẽ xác định cấu trúc chất phân lập.
2.2.3. Đánh giá tác dụng gây độc tế bào ung thư của Cỏ seo gà
Thử tác dụng gây độc tế bào của dịch chiết phân đoạn ethyl acetat và chất phân lập được từ Cỏ seo gà bằng phương pháp MTS-xác định độc tính với tế bào ung thư trong mô hình in vitro.
2.2.3.1. Nguyên tắc
MTS là 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2- (4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium. Khi có mặt phenazinemethosulfat (PMS), MTS sẽ được enzym ty thể của tế bào sống chuyển hóa thành dẫn chất formazan có màu, tan trong môi trường nuôi cấy. Lượng formazan tạo ra tỷ lệ
20
thuận với lượng tế bào sống trong môi trường nuôi cấy và được xác định bằng phương pháp đo quang ở bước sóng 490 nm.
2.2.3.2. Quy trình thí nghiệm
Chuẩn bị tế bào
Các dòng tế bào được hoạt hóa và nhân nuôi ở điều kiện thích hợp. Nạp các tế bào vào đĩa 96 giếng, mỗi giếng chứa 5000-7000 tế bào trong 180 μl môi trường nuôi cấy thích hợp. Ủ trong tủ ấm 37oC, 5% CO2 trong 24 giờ để tế bào ổn định và bám đều lên mặt đĩa.
Chuẩn bị dung dịch thuốc trung gian và ủ chất
Pha dung dịch trung gian tương ứng có nồng độ cao gấp 10 lần nồng độ cuối cần thử trong giếng. Bổ sung 20 μl dung dịch trung gian tương ứng rồi lắc nhẹ để thuốc phân bố đều trong giếng. Ủ 48 giờ ở 37oC, 5% CO2.
Ủ MTS và đo mật độ quang
Chuẩn bị dung dịch MTS/PMS với tỉ lệ 1PMS : 20MTS. Thêm 30 μl hỗn hợp trên vào mỗi giếng đang chứa 200 μl dung dịch môi trường nuôi cấy. Ủ hỗn hợp trên trong 3 giờ với điều kiện 37oC, 5% CO2 rồi tiến hành đo mật độ quang học (OD) ở bước sóng 490 nm trên hệ máy ELISA (BioRad).
2.2.3.3. Tính toán số liệu và ghi kết quả
Các giá trị OD được xử lý bằng phần mềm thống kê GraphPad Prism5.
Vẽ đường cong phụ thuộc nồng độ (đường cong tăng trưởng phụ thuộc nồng độ của các dòng tế bào thử nghiệm đối với các phân đoạn).
Tính chỉ số IC50.
Chỉ số IC50 của một chất với một dòng tế bào được tính là nghiệm của phương trình hồi quy biểu diễn tương quan giữa x (là nồng độ hay log nồng độ chất thử đó) và y (là chỉ số tăng sinh A(%)) của dòng tế bào đó khi được ủ với chất thử ở các nồng độ khác nhau.
Dựa vào giá trị của mật độ quang học đo được, xác định % tỷ số tăng sinh A của tế bào theo công thức:
21 % 100 VH T A Trong đó:
A (%): tỷ số tăng sinh của tế bào.
VH: là giá trị trung bình của mật độ quang học ở các giếng với dung môi dùng để pha hoạt chất.
T: là giá trị trung bình của mật độ quang học ở các giếng thử với hoạt chất.
2.2.3.4. Đánh giá kết quả
Theo tiêu chuẩn đánh giá của NCI (Viện Nghiên cứu Quốc gia về Ung thư Hoa Kỳ) [44].
Các chất chiết tự nhiên dạng thô có:
IC50 < 100 μg/ml được coi là có hoạt tính ức chế tế bào ung thư. IC50 ≤ 20 μg/ml là có hoạt tính mạnh.
22
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM
3.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CỦA CỎ SEO GÀ 3.1.1. Đặc điểm hình thái và giám định tên khoa học
3.1.1.1. Đặc điểm hình thái cây
Cây cỏ, cao 30-50 cm, thân rễ nhỏ ngắn mọc bò (hình 3.1 và hình 3.2).
Thân rễ nhỏ, cứng, cong queo, màu nâu, dài 3-5 cm (hình 3.6).
Lá mọc thẳng từ thân rễ, cuống lá dài (hình 3.7) xẻ sâu hình lông chim hai lần, nhẵn gân lá rõ. Có hai loại lá:
Lá không sinh sản (bất thụ) ngắn, có cuống mang dài 6-15 cm, phiến lá dài từ 8-25 cm, màu lục nhạt hơi vàng, các thùy to nhỏ không đều mọc đối nhau, mép hơi khía răng có đầu tròn riêng thùy tận cùng thuôn dài hình mũi nhọn (hình 3.3).
Lá sinh sản (hữu thụ) dài, có cuống dài 10-50 cm, phiến lá dài 10-40 cm, màu đen sẫm gồm các thùy hình dải thuôn uốn éo, mọc đối, đầu nhọn hoắt. Cuống lá rất dài màu nâu nhạt ở gốc, hơi vàng ở phía trên (hình 3.4).
Hai bên mép lá hữu thụ gập lại mang cơ quan sinh sản gọi là ổ nang (túi bào tử) dày đặc (hình 3.5 và hình 3.8).
Túi bào tử màu nâu đỏ; bào tử nhỏ, hơi tròn, màu nâu nhạt (hình 3.9).
3.1.1.2. Giám định tên khoa học
Để giám định tên khoa học cho loài nghiên cứu, mẫu cây được thu hái vào mùa sinh sản, điều này giúp cho việc nhận biết các mẫu cây được chính xác. Dựa vào các đặc điểm quan sát, phân tích về đặc điểm hình thái; đối chiếu với các tài liệu tham khảo và được sự giúp đỡ của TS. Đỗ Thị Xuyến - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Cỏ seo gà dùng để nghiên cứu đã được giám định tên khoa học là Pteris multifida Poir., họ Ráng seo gà (Pteridaceae) (Phụ lục 1).
23
Hình 3.1. Cỏ seo gà mọc tự nhiên Hình 3.2. Toàn cây Cỏ seo gà
24
Hình 3.5. Lá sinh sản có mép lá gập lại mang túi bào tử.
Hình 3.7. Cuống lá Cỏ seo gà
Hình 3.6. Thân rễ Cỏ seo gà
Hình 3.8. Túi bào tử dày đặc ở mép lá (quan sát bằng kính soi nổi)
Hình 3.9. Túi bào tử và bào tử. (quan sát bằng kính soi nổi)
3.1.2. Đặc điểm vi phẫu lá
a) Quan sát tiêu bản vi phẫu lá (hình 3.10), nhận thấy:
Phần gân lá: Phía trên có 2 mép rìa nhô ra, ở giữa lõm vào, phía dưới
25
liên tục, đều đặn, có mang lông tiết chân đơn bào ngắn, đầu tròn gồm 1 hoặc 2 tế bào (2). Mô mềm (3) gồm các tế bào thành mỏng, hình tròn, đa giác xếp lộn xộn. Nội bì (4) bao gồm 1 hàng tế bào hình chữ nhật nối với nhau thành hình tròn ôm lấy bó libe-gỗ nằm ở giữa gân lá. Ngay sát lớp nội bì là lớp trụ bì (7) cấu tạo bởi 1-2 lớp tế bào hình tròn, đa giác bao bọc lấy bó libe – gỗ. Libe (6) gồm những tế bào màu hồng đậm sắp xếp giống hình tim nằm ngay sát lớp trụ bì, tạo thành vòng bao quanh gỗ. Mô gỗ hình chữ V (5).
b) Quan sát tiêu bản vi phẫu cuống lá (hình 3.11), nhận thấy:
Vi phẫu cuống lá có mặt cắt hình vuông lồi ở 4 góc. Từ ngoài vào trong có biểu bì (2) là 1 lớp tế bào ngoài cùng xếp sát vào nhau, đều đặn. Màng ngoài có lớp cutin mỏng bao bọc (bắt màu xanh), có mang lông tiết (1). Mô mềm (3) gồm nhiều lớp tế bào hình đa giác, có góc tròn, tại các góc có những khoảng gian bào nhỏ. Trụ bì (7) là một hàng tế bào hình tròn, đa giác xếp sát nhau giống hình tim bao quanh bó libe-gỗ. Bên ngoài trụ bì là 1 lớp nội bì (4) bao gồm các tế bào hình chữ nhật, bắt màu hồng xếp đều đặn, ngăn cách mô mềm và bó trụ. Bó libe-gỗ nằm ngay sát bên trong trụ bì. Libe (5) nằm ở ngoài gồm các tế bào màu hồng đậm xếp sát nhau tạo thành hình trái tim bao quanh mô gỗ. Mô gỗ gồm các tế bào bắt màu xanh có hình chữ V (6).
3.1.3. Đặc điểm vi phẫu thân rễ
Quan sát tiêu bản vi phẫu thân rễ (hình 3.12), nhận thấy:
Lớp ngoài cùng là biểu bì (1) . Mô mềm gồm các tế bào thành mỏng, xếp không đều (2). Có 3-5 bó libe-gỗ không đều nhau, hình elip. Mỗi bó được bao quanh bởi lớp trụ bì (4) gồm 1 - 2 hàng tế bào bắt màu hồng hình tròn, đa giác xếp sát nhau thành hình elip, tròn hay trái tim. Bao bọc bên ngoài lớp trụ bì là 1 lớp nội bì (3) bao gồm 1 hàng tế bào bắt màu hồng nhạt, hình chữ nhật xếp đều đặn. Libe nằm bên trong ngay sát lớp trụ bì gồm các tế bào bắt màu hồng đậm hơn nội bì xếp sát nhau bao quanh mô gỗ (5). Mô gỗ (6) gồm các tế bào bắt màu xanh có kích thước khác nhau nằm ở trong cùng bó libe-gỗ.
26 Hình 3.10. Vi phẫu lá Cỏ seo gà Ghi chú 1. Biểu bì trên 2. Lông tiết 3. Mô mềm gân lá 4. Nội bì 5. Gỗ 6. Li be 7. Trụ bì 8. Biểu bì dưới 1. Lông tiết 2. Biểu bì 3. Mô mềm 4. Nội bì 5. Libe 6. Gỗ 7. Trụ bì
27
Hình 3.12. Vi phẫu thân rễ Cỏ seo gà
3.1.4. Đặc điểm bột lá
Lá được phơi sấy khô, tán thành bột mịn. Bột có màu xanh lục, mùi thơm. Quan sát bột dưới kính hiển vi (hình 3.13), nhận thấy: Mảnh biểu bì (1). Mảnh mạch thang (2) và mảnh mạch vạch (3). Bó sợi (4). Hạt tinh bột hình tròn đứng riêng rẽ, rốn hạt phân nhánh (5). Lỗ khí (6). Mảnh mô mềm gồm các tế bào hình tròn, thành mỏng (7). Bào tử màu vàng nâu, có nhiều u