3.3.3.1. Chuẩn bị đĩa 96 giếng phủ agarose
Hòa tan agarose trong nước cất khử trùng nồng độ 3% (3 g/100 ml).
Đun nóng agarose bằng lò vi sóng ở nhiệt độ 102oC trong 15 phút.
Làm nóng môi trường nuôi cấy bằng tủ sấy ở 70oC trong 5 phút.
Pha agarose 3% trên với môi trường đã đun nóng (tỷ lệ 1:1) được agarose 1,5%.
Nhỏ 50 μl agarose trên vào mỗi giếng.
Sau 2 giờ để agarose đông hoàn toàn, nhỏ tiếp 130 μl môi trường/giếng.
3.3.3.2. Chuẩn bị tế bào
Hoạt hóa tế bào từ Nitơ lỏng:
Rã đông nhanh tế bào lưu giữ trong Nitơ lỏng (-196oC) bằng bể ổn nhiệt 37oC. Phân tán tế bào trong môi trường nuôi cấy thích hợp (khoảng 7 ml MT) trong ống Falcon 15 ml.
49
Đem ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút.
Thu tế bào lắng, phân tán tế bào trong môi trường nuôi cấy thích hợp có bổ sung 20% FBS, ủ trong tủ ấm 37oC, 5% CO2. Nuôi tế bào đến khi tế bào bám mặt đĩa nuôi cấy khoảng 75-90% thì tiến hành thu tế bào.
Thu tế bào:
Sử dụng trypsin để tách tế bào khỏi mặt đĩa nuôi cấy. Xác định số lượng tế bào bằng buồng đếm Thoma.
3.3.3.3. Nạp tế bào vào các đĩa 96 giếng
Các tế bào đã hoạt hóa nhân nuôi ở điều kiện thích hợp được đưa vào đĩa 96 giếng, mối giếng chứa 5000-7000 tế bào trong 180 μl l môi trường nuôi cấy. Trộn nhẹ để các tế bào phân tán đều trong giếng. Ủ trong tủ ấm 37oC, 5% CO2 trong 24 giờ để tế bào ổn định và bám đều lên mặt đĩa.
3.3.3.4. Ủ với thuốc thử
Sau 24 giờ nuôi cấy, đĩa thí nghiệm được cho thêm vào mỗi giếng 20 μl dịch thuốc đã pha trong môi trường nuôi cấy có nồng độ đặc gấp 10 lần liều thử. Tế bào được ủ với các mẫu thử và taxol ở nồng độ theo bảng 3.11. Lắc nhẹ để thuốc phân bố đều trong giếng, ủ 48 giờ ở 37oC, 5% CO2.
Bảng 3.11. Dải nồng độ thử nghiệm của các mẫu thử và taxol (đơn vị μg/ml)
Kí hiệu C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 Nồng độ (µg/ml) 500 250 125 62,500 31,250 15,625 7,813 3,906 1,953 Taxol (chứng dương) 30 3 0,300 0,030 0,003 3.3.3.5. Ủ MTS và đo mật độ quang học
Chuẩn bị dung dịch MTS/PMS với tỷ lệ 20:1
Thêm 30 μl hỗn hợp trên vào mỗi giếng đang chứa 200 μl dung dịch môi trường nuôi cấy.
50
Ủ hỗn hợp trên trong 3 giờ, điều kiện 37oC, 5% CO2 rồi tiến hành đo mật độ quang học ở bước sóng 490 nm trên hệ máy LEISA.
3.3.3.6. Xử lý số liệu
Các giá trị OD được xử lý bằng phần mềm thống kê GraphPad Prism5 thu được đường cong tăng trưởng phụ thuộc nồng độ của các dòng tế bào thử nghiệm với các mẫu thử và các giá trị IC50.