2.2.2.1. Định tính:
Định tính các nhóm chất thường gặp trong dược liệu bằng phản ứng hóa học [2], [3], [12].
Định tính cắn methanol bằng sắc ký lớp mỏng [7], [12], [17].
2.2.2.2. Chiết xuất:
Xác định độ ẩm: Lấy khoảng 2 g bột dược liệu để xác định độ ẩm. Bật máy đo độ ẩm, điều chỉnh nhiệt độ 1100C. Trải đều dược liệu lên đĩa cân, đậy đĩa cân và đợi máy tự động hiển thị kết quả. Tiến hành 3 lần cho 3 mẫu ở 3 vị trí khác nhau để lấy giá trị trung bình.
Chiết xuất bằng phương pháp ngâm ở nhiệt độ phòng [2], [6], [12]. Dược liệu đã nghiền nhỏ đến kích thước thích hợp (bột thô) cho vào bình kín ở nhiệt độ phòng với dung môi methanol 80%, sau khi ngâm 2 ngày, gạn, ép dịch chiết, lọc tạp chất. Bã thu được tiến hành ngâm lần 2, lần 3 tương tự lần 1.
18
Dịch chiết thu được đem cất thu hồi dung môi bằng máy cất quay chân không, thu được cắn.
Hiệu suất chiết được tính theo công thức:
1 100 x M b X
Trong đó: X: hiệu suất (%).
b: Khối lượng cắn (g).
M: Khối lượng dược liệu đem chiết (g).
x: Độ ẩm của dược liệu (%).
2.2.2.3. Phân lập
Phân lập các chất bằng sắc ký cột thông dụng [12].
Chuẩn bị
Chất hấp phụ: Silica gel hấp phụ pha thuận và pha đảo.
Cột sắc ký: cột sắc ký có kích thước dài 40 cm, đường kính 2,9 - 3,2 cm.
Dung môi rửa giải là hỗn hợp được pha từ các dung môi thường dùng như: n-hexan, cloroform, ethyl acetat, aceton, methanol và nước.
Tiến hành phân lập Chuẩn bị cột:
Cố định cột sắc ký trên giá đỡ, lót một lớp bông mỏng dưới đáy cột. Cân một lượng silica gel vừa đủ, phân tán trong hệ dung môi rửa giải thành một hỗn dịch đồng nhất và không có bọt khí. Mở khóa của cột, rót nhanh hỗn dịch silica gel vào cột để cho silica gel lắng tự nhiên. Bổ sung dung môi liên tục lên cột, chú ý không để cột bị khô hay làm xáo trộn lớp silica gel bề mặt. Sau khi dung môi chảy được 2 giờ thì bổ sung dung môi đến gần miệng cột, đậy nút mài và để yên 12 giờ rồi tiến hành đưa mẫu lên cột.
Nạp mẫu lên cột:
Hòa mẫu phân lập trong dung môi thích hợp. Trộn đều với 1 lượng vừa đủ silica gel, sấy khô rồi tán thành bột tơi xốp. Cho bột lên cột thật đều, rải
19
thành 1 lớp đều đặn trên mặt. Sau khi lớp bột mang mẫu ổn định, rắc thêm 1 lớp mỏng silica gel lên trên bề mặt để tránh tình trạng xáo động mặt cột khi cho dung môi rửa giải lên cột.
Rửa giải:
Phản hấp phụ bằng hệ dung môi thích hợp, kiểm soát tốc độ dòng chảy, hứng dịch rửa giải vào các bình nón hoặc ống nghiệm với thể tích thích hợp.
Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng, gộp những phân đoạn có thành phần tương tự nhau thành các phân đoạn mới.
Tinh chế các chất phân lập
Sử dụng phương pháp kết tinh lại hoặc rửa nhiểu lần bằng dung môi ít hòa tan các chất phân lập.
Kiểm tra độ tinh khiết của các chất phân lập
Độ tinh khiết của chất phân lập được kiểm tra bằng phương pháp SKLM. Mỗi chất phân lập được kiểm tra bằng nhiều hệ dung môi khác nhau.
2.2.2.4. Nhận dạng chất phân lập
Các chất phân lập được ở dạng tinh khiết (đã được kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM) được lấy mẫu để đo phổ khối, phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D-NMR) và hai chiều (2D-NMR). Sau đó, căn cứ vào các dữ liệu phổ thu được sẽ xác định cấu trúc chất phân lập.