Thân rễ phơi sấy khô, tán thành bột mịn. Bột có màu nâu đen, mùi thơm. Quan sát bột dưới kính hiển vi (hình 3.14), nhận thấy: Mảnh mạch thang (1), tế bào mô cứng riêng lẻ, màu nâu thành dày (2), mảnh mô mềm mang tinh bột (3), tinh thể calci oxalat hình cầu gai (4), sợi (5).
Hình 3.14. Một số đặc điểm bột thân rễ Cỏ seo gà.
3.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CỎ SEO GÀ 3.2.1. Chiết xuất
3.2.1.1. Xác định độ ẩm dược liệu
Tiến hành xác định độ ẩm của bột Cỏ seo gà, thu được kết quả như bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả xác định độ ẩm bột Cỏ seo gà
STT Lượng dược liệu
trước khi sấy (g) Độ ẩm (%)
1 2,008 15,9
2 2,003 16,02
3 2,012 15,87
Trung bình 15,93
Kết quả: độ ẩm dược liệu là 15,93%
1: Mảnh mạch thang. 2: TB mô cứng
3: Mảnh mô mềm mang tinh bột.
4: Tinh thể calci oxalat 5: Sợi
29
3.2.1.2. Chiết xuất
Cân chính xác khoảng 950 g bột dược liệu khô, chiết bằng phương pháp ngâm ở nhiệt độ phòng với dung môi methanol 80% (làm 3 lần, mỗi lần 2 ngày). Lọc, dịch lọc được gộp chung, đem cất thu hồi dung môi và cô đến khối lượng không đổi thu được 48,39 g cắn toàn phần. Cắn được hòa tan vào nước cất nóng 60°C. Dịch chiết nước được tiến hành chiết lỏng-lỏng lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan, cloroform, ethyl acetat. Thu được 3 phân đoạn dịch chiết. Các dịch chiết được cất thu hồi dung môi đến cắn có khối lượng không đổi, kí hiệu tương ứng là cắn H, cắn C và cắn E. Quá trình chiết xuất được tiến hành như trong hình 3.15.
Hiệu suất của cắn 3 phân đoạn so với cắn toàn phần và so với nguyên liệu khô được trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Hàm lượng cắn các phân đoạn chiết xuất từ Cỏ seo gà
STT Phân đoạn Khối lượng cắn (g) % so với cắn toàn phần
% so với nguyên liệu khô
1 n-hexan 10,67 22,05 1,12
2 Cloroform 8,00 16,53 0,84
30
Hình 3.15. Sơ đồ chiết xuất cắn các phân đoạn từ Cỏ seo gà
Dược liệu
Dịch chiết methanol
Methanol
Cắn toàn phần Methanol thu hồi
Dịch chiết nước
Nước cất 600C
n-hexan
Dịch chiết n-hexan
n-hexan thu hồi
Cắn H Dịch chiết nước Dịch chiết cloroform chloroform Cloroform Cắn C
Cloroform thu hồi
Dịch chiết nước
Ethyl acetat
Dịch chiết nước Dịch chiết ethyl acetat
Cắn E
31
3.2.2. Định tính các nhóm chất trong dược liệu và cắn các phân đoạn bằng các phản ứng hóa học
3.2.2.1. Định tính các nhóm chất trong dược liệu
Tiến hành chiết xuất và xác định sự có mặt của các nhóm chất trong mẫu nghiên cứu dựa trên các phản ứng hóa học thường quy (Phụ lục 2). Kết quả được thể hiện trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả định tính các nhóm chất trong Cỏ seo gà.
Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Kết luận
1 Flavonoid
Phản ứng với dung dịch NaOH 10% ++
Có Phản ứng với dung dịch FeCl3 5% ++
Phản ứng Cyanidin ++ Phản ứng diazo hóa + 2 Glycosid tim Phản ứng Libermann-Burchardt + Không có Phản ứng Legal - Phản ứng Baljet - Phản ứng Keller-Kiliani +
3 Saponin Quan sát hiện tượng tạo bọt - Không có
4 Coumarin Phản ứng mở, đóng vòng lacton + Có Phản ứng diazo hóa + Phản ứng huỳnh quang + 5 Tanin
Phản ứng với dung dịch FeCl3 5% +
Có Phản ứng với dung dịch gelatin 1% +
Phản ứng dung dịch chì acetat 10% +
6 Anthranoid Vi thăng hoa - Không có
Phản ứng Borntraeger -
7 Alcaloid
Phản ứng với TT Mayer -
Phản ứng với TT Dragendorff -
Phản ứng với TT Bouchardat -
8 Acid hữu cơ Phản ứng với Na2CO3 + Có
9 Đường khử Phản ứng với TT Fehling A và Fehling B ++ Có
10 Acid amin Phản ứng với TT Ninhydrin 3% ++ Có
11 Chất béo Tạo vết mờ trên giấy - Không có
12 Caroten Phản ứng với H2SO4 đặc - Không có
13 Sterol Phản ứng Liebermann ++ Có
14 Polysaccharid Phản ứng với TT Lugol + Có
Không có
32
Nhận xét: Kết quả sơ bộ thấy trong Cỏ seo gà có chứa flavonoid,
coumarin, tanin, acid hữu cơ, đường khử, acid amin, sterol, polysaccharid; không chứa glycosid tim, saponin, anthranoid, alcaloid, chất béo, caroten.
3.2.2.2. Định tính cắn các phân đoạn
Tiến hành xác định sự có mặt của một số nhóm chất trong cắn toàn phần và cắn các phân đoạn: n-hexan, cloroform, ethyl acetat bằng phản ứng hóa học. Kết quả thể hiện ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả định tính flavonoid và coumarin trong cắn toàn phần, cắn
phân đoạn n-hexan, cloroform và ethyl acetat
STT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả TP H C E 1 Flavonoid Phản ứng cyanidin ++ - + ++
Phản ứng với dung dịch kiềm
loãng + + ++ ++
Phản ứng với dung dịch FeCl3 5% ++ + + ++
Phản ứng diazo hóa + - + ++
2 Coumarin
Phản ứng mở, đóng vòng lacton + - - +
Phản ứng diazo hóa + - + ++
Phản ứng huỳnh quang + - - +
Ghi chú: -: Phản ứng âm tính; +: Phản ứng dương tính
++: Phản ứng dương tính rõ
Nhận xét: Sơ bộ kết luận kết quả định tính sự có mặt của flavonoid và
coumarin trong dịch chiết toàn phần và cắn 3 phân đoạn cho thấy, trong cắn toàn phần xuất hiện flavonoid và coumarin; ở cắn phân đoạn n-hexan không thấy có flavonoid và coumarin; cắn phân đoạn cloroform có flavonoid và không có coumarin; ở cắn phân đoạn ethyl acetat có flavonoid và coumarin.
3.2.3. Định tính cắn toàn phần và các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng.
3.2.3.1.Định tính cắn toàn phần bằng sắc ký lớp mỏng.
33
Bản mỏng: Silica gel GF254 (Merck) tráng sẵn, được hoạt hóa ở 110°C trong 1h. Để nguội và bảo quản trong bình hút ẩm.
Hệ dung môi khai triển: Tiến hành thăm dò trên các hệ dung môi Hệ I: cloroform - aceton (95:5)
Hệ II: n-hexan - ethyl acetat (5:2) Hệ III: cloroform - ethyl acetat (6:4)
Hệ IV: toluen - ethyl acetat - acid formic (5:4:1) Hệ V : n-hexan - ethyl acetat (1:1)
Thuốc thử hiện màu: Dung dịch vanilin trong H2SO4 10% và soi dưới đèn tử ngoại bước sóng 254 nm và 365 nm.
Tiến hành: Chấm dịch chiết methanol lên bản mỏng. Sấy nhẹ cho khô, đặt vào bình sắc kí đã bão hòa dung môi. Sau khi triển khai, lấy bản mỏng ra khỏi bình, sấy nhẹ 5 phút cho bay hơi hết dung môi. Phát hiện vết dưới ánh sáng tử ngoại. Sau đó phun thuốc thử hiện màu, sấy ở nhiệt độ khoảng 110°C. Sau nhiều lần triển khai thấy hệ II tách tốt nhất (hình 3.16).
(1) (2) (3) (4)
3.2.3.2. Định tính cắn các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng.
Dịch chấm sắc ký: Cắn từng phân đoạn hòa tan trong methanol.
Hình 3.l6. Sắc ký đồ của cắn toàn phần khai triển với hệ dm II
Ghi chú: (1): Không phun TT, AST (2): Không phun TT, UV254 nm
34
Bản mỏng: Silica gel GF254 (Merck) tráng sẵn, được hoạt hóa ở 110°C trong 1h. Để nguội và bảo quản trong bình hút ẩm.
Thuốc thử hiện màu: Dung dịch vanilin trong H2SO4 10% và soi dưới đèn tử ngoại bước sóng 254 nm và 365 nm
Tiến hành: Tương tự như với cắn toàn phần.
a) Định tính cắn phân đoạn n-hexan.
Hệ dung môi khai triển: Tiến hành thăm dò trên các hệ dung môi: Hệ I: cloroform - ethyl acetat (8:2)
Hệ II: ethyl acetat - methanol - nước (8:1:1) Hệ III: n-hexan - methanol (9:1)
Hệ IV: toluen - ethyl acetat - acid formic (6:2:1) Hệ V: n-hexan - ethyl acetat (4:1)
Hệ VI: ethyl acetat - cloroform - acid formic (3:3:1) Sau nhiều lần triển khai thấy hệ V tách tốt nhất (Hình 3.17).
b) Định tính cắn phân đoạn cloroform bằng sắc ký lớp mỏng
Hệ dung môi khai triển: Tiến hành thăm dò trên các hệ dung môi: Hệ I: cloroform - aceton (95:15)
Hệ II: ethyl acetat - ethanol - nước (10:2:1) Hệ III: toluen - ethyl acetat - acid formic (5:4:1) Hệ IV: toluen - ethyl acetat - acid formic (6:2:1) Hệ V: ethyl acetat - methanol (99:1)
Sau nhiều lần triển khai thấy hệ IV tách tốt nhất (hình 3.18).
c) Định tính cắn phân đoạn ethyl acetat bằng sắc ký lớp mỏng
Hệ dung môi khai triển: Tiến hành thăm dò trên các hệ dung môi: Hệ I: ethyl acetat - acid formic - nước (50:4:10) Hệ II: toluen - ethyl acetat - acid formic (5:4:1) Hệ III: cloroform - methanol - nước (64:45:12) Hệ IV: ethyl acetat - methanol - nước (8:1:1) Sau nhiều lần triển khai thấy hệ I tách tốt nhất (hình 3.19).
35
(1) (2) (3) (4) (1) (2) (3) (4)
(1) (2) (3) (4)
3.2.4. Phân lập
Cắn ethyl acetat (8,20 g) được hòa tan bằng lượng dung môi methanol tối thiểu và được trộn với một lượng tối thiểu silica gel, làm khô cho đến khi thu được bột tơi. Hỗn hợp này sau đó được tiến hành phân tách bằng sắc ký cột, rửa giải bằng hệ dung môi gradient dicloromethan : methanol với độ phân
Hình 3.17. Sắc ký đồ của cắn phân đoạn n-hexan khai triển với hệ dm V
Hình 3.18. Sắc ký đồ của cắn phân đoạn cloroform khai triển với hệ dm IV.
Hình 3.19. Sắc ký đồ của cắn phân đoạn ethyl acetat khai triển với hệ dm I.
Ghi chú: (1): Không phun TT, AST (2): Không phun TT, UV254 nm
36
cực tăng dần (tỉ lệ 20:1, 10:1, 5:1 và 0:1), kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng, gộp các phần giống nhau thu được 4 phân đoạn chính là F4, F5, F6, F7.
Phân đoạn F6 tiến hành sắc ký trên cột pha đảo, rửa giải bằng hệ dung môi methanol : nước (1:1) thu được phân đoạn F6A. Phân đoạn F6A tiếp tục tinh chế trên cột pha đảo, rửa giải bằng hệ dung môi aceton : nước (3:7) thu được chất PM9.
Phân đoạn F7 tiến hành sắc ký trên cột pha đảo, rửa giải bằng hệ dung môi methanol : nước (1:1) thu được phân đoạn F7A, F7B. Phân đoạn F7A chạy cột sắc ký pha thường, hệ dung môi ethyl acetat : methanol : nước (6:1:0,1) thu được chất PM15. Phân đoạn F7B tiếp tục tinh chế trên cột pha đảo, rửa giải bằng hệ dung môi methanol : nước (1:2) thu được chất PM18.
methanol : nước (1:1) Cắn ethyl acetat (8,20 g) F4 F5 F6 F7 F7A F7B PM15 PM18 CC, silica gel
Gradient dicloromethan : methanol
methanol : nước (1:1)
EtOAc : MeOH : nước (6:1:0,1)
Hình 3.20. Sơ đồ phân lập PM9, PM15 và PM18 từ phân đoạn ethyl acetat chiết
xuất từ Cỏ seo gà. F6A PM9 aceton : nước (3:7) methanol : nước (1:2)
37
3.4.2.1. Kiểm tra độ tinh khiết và nhận dạng chất phân lập PM9
a) Kiểm tra độ tinh khiết
Kiểm tra độ tinh khiết của PM9 bằng sắc ký lớp mỏng trên 3 hệ dung môi Hệ I: ethyl acetat - acid formic (8:1)
Hệ II: dichlomethan - methanol - nước (4:1:0,1) Hệ III: ethyl acetat - methanol - nước (6:1:0,1)
Kết quả: Ở ánh sáng UV254 nm, PM9 chỉ xuất hiện 1 vết (Hình 3.21 và Bảng
3.5)
Bảng 3.5. Kết quả SKLM của PM9 với 3 hệ dung môi ở UV254 nm
Hệ I Hệ II Hệ III
Hình 3.21. Hình ảnh SKLM của PM9 với 3 hệ dung môi ở UV254 nm
Nhận xét: khai triển sắc ký lớp mỏng trên 3 hệ dung môi khác nhau,
PM9 đều chỉ hiện 1 vết có Rf khác nhau. Có thể sơ bộ kết luận PM9 là một hợp chất tinh khiết.
Hệ dung môi I II III
UV254 nm
Rf ×100 41,67 20 45,31
38
b) Nhận dạng chất phân lập PM9
Tính chất: tinh thể hình kim, màu vàng nhạt, tan trong ethanol hoặc DMSO.
Có công thức phân tử C27H30O14 (M = 578).
Hình 3.22. Tinh thể PM9 dưới vật kính 40
Phổ 1H-NMR của PM9 cho 4 tín hiệu của proton thơm tại δH 6,45 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 6,77 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 7,79 (2H, d, J = 9,0 Hz, H- 2ʹ), 6,92 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3ʹ) gợi ý về một khung flavonoid dạng kaempferol. Ngoài ra, 2 proton anomer của 2 phân tử đường xuất hiện ở vị trí cộng hưởng δH 5,30 (H-1ʹʹ, s) và 5,54 (H-1ʹʹʹ, s); 2 nhóm methyl bậc 3 được nhận biết ở các vị trí cộng hưởng δH 0,81 (3H, d, J = 5,5 Hz, H-6ʹʹ) và 1,13 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-6ʹʹʹ) cho thấy sự có mặt của 2 đường gốc rhamnosyl.
Trên phổ 13C-NMR và DEPT của PM9 xuất hiện 27 tín hiệu carbon, trong đó có 9 carbon bậc 4, 16 carbon bậc 3 và 2 nhóm methyl. Sự chuyển dịch về phía trường mạnh của 2 tín hiệu carbon methin tại 99,52 (C-6) và 94,70 (C-8) khẳng định vòng A ở đây bị thế tại 2 vị trí 5 và 7. Bên cạnh đó, cũng quan sát thấy 2 tín hiệu carbon anomer tại δC 101,96 (C-1ʹʹ) và 98,53 (C-1ʹʹʹ); 2 nhóm methyl tại các vị trí cộng hưởng δC 17,50 (C-6ʹʹ) và 17,94 (C-6ʹʹʹ); 1 nhóm carbonyl tại vị trí cộng hưởng δC 178,02 (C-4). Từ các dữ kiện trên cho phép ta khẳng định PM9 là một kaempferol chứa 2 phân tử đường.
39
Bảng 3.6.Dữ liệu phổ NMR của PM9
No. &δC [27] δCa,b δHa,c (mult., J in Hz) HMBC (H→C) 1 2 158,3 157,89 - 3 135,0 134,66 - 4 178,0 178,02 - 5 161,5 161,80 - 6 100,0 99,52 6,45 (d, 2,0) 5, 8, 10 7 162,3 161,80 - 8 95,0 94,70 6,77 (d, 2,0) 6, 7, 9, 10 9 156,6 156,22 - 10 106,3 105,88 - 1ʹ 121,0 120,48 - 2ʹ 131,2 130,79 7,79 (d, 9,0) 2, 4ʹ 3ʹ 116,0 115,48 6,92 (d, 8,5) 1ʹ, 4ʹ 4ʹ 160,7 160,19 - 5ʹ 116,0 115,48 6ʹ 131,2 130,49 Rhamnosid 1ʹʹ 102,4 101,96 5,30 (s) 3 2ʹʹ 70,9 70,76 3,16 (overlap) 3ʹʹ 70,6 70,31 3,43 (overlap) 4ʹʹ 72,2 71,23 3,13 (m) 5ʹʹ 71,7 71,23 3,13 (m) 6ʹʹ 18,0 17,50 0,81 (d, 5,5) Rhamnosid 1ʹʹʹ 99,3 98,53 5,54 (s) 7 2ʹʹʹ 70,8 70,76 3,16 (overlap) 3ʹʹʹ 70,6 70,76 3,16 (overlap) 4ʹʹʹ 71,2 71,23 3,31 (m) 5ʹʹʹ 70,3 70,31 3,63 (m) 6ʹʹʹ 18,5 17,94 1,13 (d, 6,5)
Chú thích: aĐo trong DMSO, b125 MHz, c500 MHz.
&δC của kaempferol-3,7-di-O-α-L-rhamnopyranosid [27]
Để khẳng định chính xác cấu trúc hóa học, chúng tôi tiến hành phân tích phổ 2 chiều HMBC và HSQC. Các tín hiệu proton được gán với các tín hiệu carbon tương ứng dựa vào phổ 2 chiều HSQC. Các vị trí liên kết được
40
khẳng định bằng kết quả phân tích phổ 2 chiều HMBC. Trên phổ HMBC quan sát thấy tương tác giữa proton anomer 5,30 (H-1ʹʹ) với tín hiệu carbon 134,66 (C-3); tương tác giữa proton anomer 5,54 (H-1ʹʹʹ)với tín hiệu carbon 161,80 (C-7). Điều này cho phép khẳng định 2 phân tử đường liên kết trực tiếp với vị trí C-3 và C-7. Các tín hiệu carbon oximethin của 2 phân tử đường này nằm trong khoảng từ 69,79 - 71,23 (8 tín hiệu CH) và có thể hoán đổi lẫn nhau. Kết hợp so sánh với số liệu phổ của PM9 với hợp chất kaempferol-3,7- di-O-α-L-rhamnopyranosid [27] thấy hoàn toàn phù hợp tại các vị trí tương ứng. Do đó, hợp chất PM9 được xác định là kaempferol-3,7-di-O-α-L- rhamnopyranosid, hay còn có tên là kaempferitrin.
Hình 3.23.Công thức cấu tạo của hợp chất PM9
3.2.4.2. Kiểm tra độ tinh khiết và nhận dạng chất phân lập PM15
a) Kiểm tra độ tinh khiết
Kiểm tra độ tinh khiết của PM15 bằng sắc ký lớp mỏng trên 3 hệ dung môi: Hệ I: ethyl acetat - methanol - nước (6:1:0,1)
Hệ II: methanol - nước (9:1)
Hệ III: ethyl acetat - acid formic (8:1)
Thuốc thử: dung dịch H2SO4 10% trong ethanol.
Kết quả : Ở ánh sáng UV254 nm PM15 chỉ xuất hiện 1 vết. (Hình 3.24 và Bảng
41
Hệ I Hệ II Hệ III
Hình 3.24. Hình ảnh SKLM của PM15 với 3 hệ dung môi ở UV254 nm
Bảng 3.7. Kết quả SKLM của PM15 với 3 hệ dung môi ở UV254 nm
Hệ dung môi I II III
UV254 nm
Rf ×100 17,98 75,90 30,12
Màu sắc Đen Đen Đen
Nhận xét: khai triển SKLM trên 3 hệ dung môi khác nhau, PM15 đều chỉ
hiện 1 vết có Rf khác nhau. Có thể sơ bộ kết luận PM15 là một hợp chất tinh khiết.
b) Nhận dạng chất phân lập PM15
Tính chất: tinh thể hình kim, màu vàng nhạt, tan trong methanol, ethanol, ethyl acetat.
Hình 3.25. Tinh thể PM15 dưới vật kính 40
Trên phổ khối lượng EIS-MS: m/z = 595,1 [M+H]+ tương ứng với công thức phân tử C27H30O15 (M = 594).
42
Quan sát trên phổ 1H-NMR của PM15 cho 4 tín hiệu của proton thơm tại δH 6,51 (H-6, d, J = 2,0 Hz); 6,76 (H-8, d, J = 2,0 Hz); 7,82 (H-2ʹ, d, J = 9,0 Hz); 6,97 (H-3ʹ, d, J = 8,0 Hz) gợi ý về một khung flavonoid dạng kaempferol. Ngoài ra 2 proton anomer ở δH 5,42 (H-1ʹʹ, d, J = 1,5 Hz) và 5,09 (H-1ʹʹʹ, d, J = 7,0 Hz) cùng với 1 nhóm methyl δH 0,96 (H-6ʹʹ, d, 6,0 Hz) và 1 nhóm oximethilen δH 3,74 (H-6ʹʹʹa, m), 3,95 (H-6ʹʹʹb, dd, 2,0, 12,0) cho thấy có thể tồn tại 1 gốc rhamnosyl và 1 gốc glucosyl.