3.2.1.1. Trên mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan
Sử dụng mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan để xác định tác dụng chống viêm cấp của cao hạt cần tây. Thông số đánh giá là mức độ phù bàn chân chuột tại các thời điểm 1; 3; 5; 7 giờ sau khi gây viêm.
Kết quả thể hiện trên hình 3.1 và bảng 3.4.
*, p < 0,05; **, p < 0,01 khi so sánh với lô chứng
Hình 3.1. Ảnh hƣởng của cao hạt cần tây đến mức độ phù chân chuột cống trắng theo thời gian
42
Bảng 3.4. Kết quả đánh giá tác dụng chống viêm trên mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenan
Lô
Mức độ phù chân chuột theo thời gian
Sau 1 giờ Sau 3 giờ Sau 5 giờ Sau 7 giờ Chứng (n = 9) M ± SE (%) 19,16 ± 3,33 26,01 ± 2,49 14,26 ± 1,97 9,18 ±1,51 Indomethacin 10mg/kg (n = 8) M ± SE (%) I (%) 6,53 ± 1,69** 65,9 13,09 ± 3,17** 49,6 8,38 ± 2,58 41,2 5,59 ± 1,79 39,1 Cần tây 250 mg/kg (n = 9) M ± SE (%) I (%) 11,94 ± 2,80* 37,6 25,13 ± 3,96 3,3 21,42 ± 3,07 - 16,37 ± 3,49 - Cần tây 500 mg/kg (n = 9) M ±SE (%) I (%) 7,54 ± 1,54* 60,6 18,02 ± 1,82 30,7 8,78 ± 1,49 38,4 4,72 ± 0,88 48,5
*, p < 0,05; **, p < 0,01 khi so sánh với lô chứng
Nhận xét:
‒ Cao hạt cần tây liều 250 mg/kg và 500 mg/kg đều có tác dụng ức chế phù bàn
chân chuột so với lô chứng tại thời điểm 1 giờ sau khi gây viêm (p < 0,05), tỷ lệ ức chế phù so với chứng lần lượt là 37,6% và 60,6%.
‒ Indomethacin liều 10 mg/kg xuất hiện tác dụng chống viêm tại thời điểm 1 giờ
(p < 0,01) và kéo dài đến thời điểm 3 giờ sau khi gây viêm (p < 0,01), tỷ lệ ức chế phù bàn chân chuột so với chứng tương ứng là 65,9% và 49,6%.
43
3.2.1.2. Trên mô hình gây viêm màng hoạt dịch khớp gối bằng tinh thể natri urat
Sử dụng mô hình gây viêm màng hoạt dịch khớp gối bằng tinh thể natri urat bằng cách tiêm tinh thể natri urat vào khớp gối sau trái của chuột cống trắng để gây viêm màng hoạt dịch. Sau khi tiêm 4, 5, 6 giờ, quan sát biểu hiện di chuyển của từng chuột. Sử dụng bảng kiểm để đánh giá mức độ viêm dựa trên triệu chứng.
Kết quả được trình bày ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Kết quả đánh giá tác dụng chống viêm trên mô hình gây viêm màng hoạt dịch khớp gối bằng tinh thể natri urat
Lô n
Điểm viêm
Sau 4 giờ Sau 5 giờ Sau 6 giờ
Chứng 9 4 (4 - 4) 4 (4 - 4) 3 (3 - 4)
Indomethacin 10 mg/kg 7 1 (1 - 1)** 1 (1 - 1)** 1 (1 - 1)**
Cần tây 250 mg/kg 10 2 (2 - 2)** 3 (3 - 4)* 3 (2 - 3)
Cần tây 500 mg/kg 10 2 (1 - 2)** 2 (1 - 3)** 2 (1 - 3)*
Số liệu được trình bày dưới dạng trung vị và khoảng (tứ phân vị).
*, p < 0,05 và **, p < 0,01 khi so sánh với lô chứng, dùng Mann - Whitney U test
Nhận xét:
‒ Chuột cống trắng ở lô chứng trên mô hình này có biểu hiện viêm khớp cấp khá
nặng do tinh thể natri urat.
‒ Cao hạt cần tây liều 250 mg/kg thể hiện tác dụng chống viêm trên mô hình này.
Điểm viêm tại thời điểm 4 giờ sau tiêm là 2 (2 - 2), giảm có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p < 0,01). Điểm viêm tại thời điểm 5 giờ sau tiêm là 3 (3 - 4), giảm có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p < 0,05).
‒ Cao hạt cần tây liều 500 mg/kg thể hiện tác dụng chống viêm tốt trong suốt quá
trình quan sát, điểm viêm tại 3 thời điểm giảm rõ rệt so với lô chứng, tương ứng là 2 (1 - 2) với p < 0,01; 2 (1 - 3) với p < 0,01 và 2 (1 - 3) với p < 0,05.
44
‒ Indomethacin liều 10 mg/kg có tác dụng chống viêm tốt, điểm viêm trong suốt
thời gian quan sát là 1 (1 - 1), điểm viêm giảm có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p < 0,01).
‒ Khi so sánh điểm viêm sau tiêm natri urat của 2 mức liều 250 mg/kg và 500 mg/kg, sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) tại các thời điểm nghiên cứu.
3.2.2. Đánh giá tác dụng giảm đau ngoại vi theo phƣơng pháp gây quặn đau bằng acid acetic
Tiêm màng bụng chuột nhắt trắng dung dịch acid acetic 1% với liều 0,1 ml/chuột. Đếm số cơn quặn đau của từng chuột ở các lô trong từng khoảng thời gian 5 phút một, kể từ ngay sau khi tiêm acid acetic 1% cho đến hết phút thứ 30.
Kết quả được trình bày ở bảng 3.6.
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của cao hạt cần tây lên số cơn quặn đau
Lô n
Số cơn quặn đau (số cơn/5 phút)
0 - 5 5 - 10 10 - 15 15 - 20 20 - 25 25 - 30 Chứng 8 2 (0 - 6) 15 (7 - 19) 15 (12 - 18) 16 (14 - 23) 17 (14 - 19) 12 (10 - 17) Indomethacin 10 mg/kg 8 0 (0 - 2) 9 (0 - 17) 11 (4 - 13)* 9 (7 - 11)* 7 (5 - 9)** 4 (0 - 8)** Cần tây 250 mg/kg 8 1 (0 - 2) 10 (6 - 13) 11 (7 - 12)** 9 (7 - 11)* 7 (4 - 9)** 7 (5 - 10)** Cần tây 500 mg/kg 9 1 (0 - 5) 13 (11 - 17) 15 (13 - 17) 12 (11 - 18) 13 (8 - 17) 10 (9 - 12)
Số liệu được trình bày dưới dạng trung vị và khoảng (tứ phân vị)
45
Nhận xét:
‒ Cao hạt cần tây liều 250 mg/kg làm giảm số cơn quặn đau của chuột nhắt trắng
so với lô chứng trong khoảng thời gian từ phút thứ 10 đến 15 (p < 0,01); từ phút 15 đến 20 (p < 0,05); từ phút 20 đến 25 (p < 0,01); từ phút 15 đến 20 (p < 0,01).
‒ Cao hạt cần tây liều 500 mg/kg không thể hiện tác dụng giảm đau ngoại vi thông
qua việc không làm giảm số cơn quặn đau trên chuột nhắt trắng so với lô chứng trong toàn bộ thời gian quan sát.
‒ Thuốc đối chiếu indomethacin liều 10mg/kg thể hiện tác dụng giảm đau tốt, làm
giảm số cơn quặn đau trong khoảng thời gian từ phút thứ 10 đến 15 (p < 0,05); từ phút 15 đến 20 (p < 0,05); từ phút 20 đến 25 (p < 0,01); từ phút 15 đến 20 (p < 0,01).
3.3. XÁC ĐỊNH ĐỘC TÍNH CẤP
Trong thử nghiệm thăm dò
Sử dụng 10 chuột nhắt trắng, chia làm 5 lô, mỗi lô 2 con được uống cao hạt cần tây với liều tăng dần. Kết quả sau 4 - 6 giờ, cả 10 chuột đều bình thường, sau 72 giờ cả 10 chuột đều còn sống và không xuất hiện chuột chết trong vòng 7 ngày sau khi uống thuốc.
Kết thúc thử nghiệm thăm dò đã xác định được liều cao nhất có thể cho chuột uống được mà không gây chết chuột nhắt trắng thí nghiệm (liều 40 g cao/kg).
Trong thử nghiệm chính thức
Sử dụng 10 chuột nhắt trắng giống cái, trước đó 2 giờ, cho chuột nhịn ăn nhưng vẫn cho uống nước bình thường. Cho cả 10 chuột uống cao hạt cần tây liều cao nhất đã xác định ở thử nghiệm thăm dò (liều 40 g/kg). Thể tích mỗi lần cho chuột uống là 0,2 ml/10g chuột, ngày uống 2 lần, cách nhau 3 giờ. Sau 2 giờ chuột được cho ăn trở lại, uống nước bình thường.
Sau khi uống thuốc 4 - 6 giờ, tất cả các chuột đều không có biểu hiện bất thường: chuột ăn uống, vận động bình thường, không khó thở, lông mượt, niêm mạc hồng hào, mắt sáng, phân khô, nước tiểu bình thường, không bị tiêu chảy. Trong
46
vòng 72 giờ sau khi uống thuốc, không xuất hiện chuột chết và 100% số chuột thử nghiệm đều còn sống sau một tuần thử nghiệm.
Như vậy với liều 40 g/kg (tương đương 1,1 kg bột hạt cần tây/kg, liều này gấp khoảng 160 lần liều thể hiện tác dụng dược lý), là liều cao nhất có thể cho chuột uống được, cao hạt cần tây không thể hiện độc tính cấp trên chuột nhắt trắng.
Vì không có chuột chết ở các lô thử nghiệm nên chưa xác định được độc tính cấp và LD50 của cao hạt cần tây.
47
Chƣơng 4. BÀN LUẬN
4.1. VỀ TÁC DỤNG HẠ ACID URIC HUYẾT THANH THỰC NGHIỆM
Biểu hiện lâm sàng và cơ chế bệnh sinh của bệnh gút liên quan mật thiết đến sự tăng acid uric huyết thanh và hiện tượng gây viêm của tinh thể natri urat. Các thuốc được dùng để điều trị gút hiện nay hầu hết đều có tác dụng chống viêm hoặc hạ acid uric huyết thanh hoặc cả hai tác dụng này.
Để đánh giá tác dụng hỗ trợ điều trị gút của cao hạt cần tây, trước hết đề tài tiến hành thăm dò tác dụng hạ acid uric huyết thanh thực nghiệm trên mô hình động vật đã bị gây tăng acid uric máu. Các thuốc có tác dụng hạ acid uric huyết thanh thường theo một trong ba cơ chế sau: ức chế enzym xanthin oxidase; tăng thải trừ acid uric qua thận và tiêu acid uric. Đề tài lựa chọn tiếp cận nghiên cứu theo hướng ức chế enzym XO làm hạ acid uric máu.
Để lựa chọn được qui trình chiết xuất cao hạt cần tây có tiềm năng nhất trong 3 mẫu cao đặc được chiết xuất theo 3 qui trình khác nhau (do TS. Nguyễn Thu Hằng và nhóm nghiên cứu thực hiện tại Bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội), đề tài tiến hành bước sàng lọc ban đầu thông qua việc đánh giá khả năng ức chế XO in vitro. Từ đó, tiếp tục đánh giá khả năng hạ acid uric huyết thanh trên
mô hình gây tăng cấp acid uric và khả năng ức chế XO in vivo của qui trình đã lựa
chọn.
4.1.1. Về sự lựa chọn qui trình chiết xuất cao đặc có tiềm năng tốt nhất thông qua đánh giá tác dụng ức chế XO in vitro
Đánh giá tác dụng ức chế XO in vitro là phương pháp rất thích hợp cho các
nghiên cứu sàng lọc. Một chất/nhóm chất có tác dụng ức chế XO in vitro chưa chắc
đã có tác dụng ức chế XO in vivo, nhưng nếu chất/nhóm chất có tác dụng ức chế
XO in vitro thì sẽ là định hướng tốt cho các giai đoạn nghiên cứu tiếp theo. Ba mẫu
48
phản ứng được thử 3 lần, mỗi lần thử tiến hành trong 3 giếng. Phương pháp xác
định khả năng ức chế XO in vitro được sử dụng có đặc điểm dễ thực hiện, tiết kiệm
thời gian, chi phí nghiên cứu, kết quả có độ chính xác, độ lặp cao, hạn chế tối đa sai số. Phương pháp này dựa trên cơ sở các công bố của hai tác giả Noro T. [63] và Nguyễn T.M. [62] được điều chỉnh cho phù hợp với điều kiện thực nghiệm trong nước.
Kết quả của nghiên cứu (bảng 3.1) cho thấy, tại nồng độ 100 µg/ml, cả 3 qui
trình QT1, QT2, QT3 đều thể hiện khả năng ức chế hoạt tính XO in vitro có ý nghĩa
thống kê so với lô chứng (p < 0,05 và p < 0,01), tỉ lệ ức chế lần lượt là 15,5%; 19,7% và 39,8%. Khi so sánh 3 qui trình này nhận thấy, qui trình 3 (QT3) có khả năng ức chế XO in vitro mạnh hơn 2 qui trình còn lại (p < 0,01). Từ các kết quả trên, đề tài quyết định lựa chọn qui trình 3 là qui trình chiết xuất cao hạt cần tây dùng cho các nghiên cứu in vivo tiếp theo.
Quay trở lại tìm hiểu sự khác biệt trong qui trình chiết xuất của 3 mẫu cao này (hình 2.3, 2.4, 2.5), nhóm nghiên cứu nhận thấy qui trình 1 và 2 đều là dịch chiết ethanol toàn phần chưa loại chất béo của hạt cần tây, vì thế tỉ lệ ức chế XO của 2 qui trình này không có sự khác biệt (p > 0,05), với tỉ lệ ức chế tương đối đồng đều là 15,5% và 19,7%. Riêng qui trình 3 là dịch chiết ethanol toàn phần nhưng đã thêm công đoạn lắc với ether dầu hỏa để loại hết chất béo, vì vậy khả năng ức chế XO của qui trình 3 có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với 2 qui trình còn lại (p < 0,01). Điều đó chứng tỏ cao chiết đã loại chất béo có tác dụng ức chế XO tốt hơn so với cao không loại chất béo.
4.1.2. Về ảnh hƣởng của cao hạt cần tây đến nồng độ acid uric huyết thanh trên mô hình gây tăng acid uric cấp thực nghiệm bằng kali oxonat
Sau khi đã tiến hành sàng lọc để tìm ra được qui trình chiết xuất cao hạt cần tây có tác dụng ức chế XO in vitro mạnh nhất, đề tài tiếp tục đánh giá tác dụng
in vivo của cao hạt cần tây trên mô hình gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonat. Đây là mô hình đã được sử dụng rất phổ biến trong thực nghiệm để đánh giá tác dụng hạ acid uric huyết thanh của thuốc [46], [61]. Cơ chế gây tăng acid uric máu
49
của kali oxonat do ức chế enzym uricase ở gan chuột. Uricase giúp chuyển hóa acid uric thành allantoin - một chất dễ tan và dễ thải ra ngoài qua thận [5].
Theo nghiên cứu của Mohamed D.A., cao toàn phần methanol từ lá và hạt cần tây liều 500 mg/kg trên chuột cống trắng có tác dụng hạ acid uric huyết thanh [56]. Dựa vào kết quả này, đề tài đã sử dụng 3 mức liều 250 mg/kg, 500 mg/kg và 1000 mg/kg để thiết kế nghiên cứu. Dược liệu là hạt cần tây được ngâm lạnh với ethanol 96%, cất thu hồi dung môi tạo dịch chiết đặc. Dịch chiết được pha loãng với nước, lắc với ether dầu hỏa để loại chất béo. Sản phẩm thu được đem cô cách thủy ở
800C tạo thành cao đặc. Cả ethanol và methanol đều có khả năng hòa tan các chất
mang tính chọn lọc, tuy nhiên do methanol có độc tính cao hơn nên đề tài của chúng tôi lựa chọn ethanol 96% làm dung môi chiết xuất.
Kết quả của nghiên cứu, cao hạt cần tây cả 3 mức liều 250 mg/kg, 500 mg/kg và 1000 mg/kg đều làm giảm acid uric huyết thanh có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p < 0,01), tỉ lệ giảm lần lượt là 59,3%; 52,6% và 43,8%. Tuy nhiên sự khác biệt giữa 3 mức liều trên không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Vì thế các nghiên cứu tiếp theo đề tài chỉ sử dụng 2 mức liều thấp hơn là 250 mg/kg và 500 mg/kg.
Trong nghiên cứu của Mohamed D.A. trên chuột cống, nồng độ acid uric huyết thanh ở lô chứng là 190 µmol/l. Lô thử dùng cao hạt cần tây (chiết xuất bằng dung môi methanol) với mức liều 500 mg/kg có nồng độ acid uric huyết thanh là 119 µmol/l; tỉ lệ giảm so với lô chứng là 38%. Nồng độ acid uric máu ở 2 lô thử cao hạt cần tây đều giảm có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p < 0,001) [56]. Có thể thấy, kết quả nghiên cứu của chúng tôi khá tương đồng với nghiên cứu đã công bố của Mohamed D.A.
4.1.3. Về khả năng ức chế XO in vivo
Kết quả đánh giá khả năng ức chế XO in vitro đã thực hiện cho thấy cao hạt
cần tây có nhiều tiềm năng. Trên mô hình gây tăng acid uric huyết thanh thực nghiệm, cao hạt cần tây cho thấy tác dụng làm giảm nồng độ acid uric huyết thanh động vật thí nghiệm. Đây là những tiền đề tốt để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo. Câu hỏi tiếp theo được đặt ra trong nghiên cứu này là liệu cao hạt cần tây có tác
50
dụng ức chế XO in vivo hay không. Để khẳng định cần phải tiến hành thử nghiệm
đánh giá tác dụng ức chế XO in vivo trên gan chuột nhắt trắng. Khác với nghiên cứu
ức chế XO in vitro (thường dùng enzym tinh khiết phản ứng với cơ chất cùng với sự
có mặt của chất thử trong dung dịch đệm [47], [62]), ở nghiên cứu đánh giá tác
dụng ức chế XO in vivo, động vật thí nghiệm được dùng thuốc thử. Sau một thời
gian, chiết xuất enzym gan, xác định hoạt độ để đánh giá mức độ ảnh hưởng của chế phẩm thử lên enzym XO [46], [61].
Kết quả của nghiên cứu cho thấy, cả 2 mức liều 250 mg/kg và 500 mg/kg của
cao hạt cần tây đều thể hiện khả năng ức chế XO in vivo thông qua việc làm giảm
độ hấp thụ quang của acid uric có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p < 0,05), tỉ lệ giảm tương ứng lần lượt là 12,1% và 10,5%. Sự khác biệt giữa 2 mức liều 250 mg/kg và 500 mg/kg không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
Rất nhiều nghiên cứu đã xác định thành phần hóa học chính của hạt cần tây là flavonoid, tinh dầu, coumarin… [9]. Flavonoid là nhóm hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học mạnh với nhiều tác dụng quan trọng như: chống oxy hóa, bảo vệ gan, kháng khuẩn, kháng virus, chống ung thư, chống viêm, chống dị ứng... Gần đây, các