32
Trên mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan
Thiết kế thí nghiệm
Sử dụng mô hình gây phù bằng carrageenan theo Winter [87].
Chuột cống trắng đực được nuôi ổn định trong phòng thí nghiệm và được chia ngẫu nhiên thành 4 lô:
‒ Lô chứng: uống dung môi Na-CMC 0,5%.
‒ Lô đối chiếu: uống indomethacin liều 10 mg/kg pha trong Na-CMC 0,5%.
‒ Lô thử 1, 2: lần lượt uống cao hạt cần tây liều 250 mg/kg và 500 mg/kg pha trong Na-CMC 0,5%.
Chuột ở các lô được uống thuốc tương ứng với cùng thể tích 1 ml/100 g chuột vào một giờ nhất định hàng ngày trong vòng 5 ngày trước khi làm thực nghiệm. Trước khi dùng thuốc 1,5 giờ chuột không được ăn nhưng được uống nước bình thường. Ngày thứ 5, sử dụng máy đo độ phù bàn chân chuột LE 7500 (hình 2.7) để đo thể tích bàn chân sau phải của từng chuột.
Sau khi uống dung môi, thuốc đối chiếu hoặc chế phẩm nghiên cứu lần cuối, chuột được tiêm 0,1 ml carrageenan 1% trong nước muối sinh lý vào gan bàn chân sau phải. Đo thể tích bàn chân sau phải của từng chuột vào các thời điểm 1, 3, 5, 7 giờ sau khi gây viêm.
Qui trình thí nghiệm được mô tả ở hình 2.11.
Hình 2.11. Qui trình đánh giá tác dụng chống viêm cấp thực nghiệm trên mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan
33
Kỹ thuật đo độ phù bàn chân chuột
Dùng bút đánh dấu cố định mặt bên khớp gối chân sau phải của chuột. Nhúng bàn chân sau phải vào dung dịch đo đến đúng vị trí đã dánh dấu, đọc kết quả hiển thị trên thiết bị đo. Kỹ thuật đo được thực hiện bởi cùng một kỹ thuật viên và là phép đo mù.
Thông số đánh giá
‒ Thể tích bàn chân sau phải của từng chuột.
‒ Mức độ phù bàn chân sau phải của từng chuột được tính theo công thức:
Trong đó: ∆V: mức độ phù bàn chân chuột tại thời điểm t giờ sau khi gây viêm. V0, Vt: thể tích bàn chân chuột trước và sau khi gây viêm t giờ.
‒ % ức chế phù của các lô thử so với lô chứng được tính theo công thức:
Trong đó: I (%): phần trăm ức chế phù của lô thử so với lô chứng.
∆Vc, ∆Vt: mức độ phù chân chuột trung bình ở lô chứng và lô thử.
Trên mô hình gây viêm màng hoạt dịch khớp gối bằng tinh thể natri urat
Sử dụng mô hình gây viêm màng hoạt dịch khớp gối bằng tinh thể natri urat của McCarty và Faires [86].
Chuẩn bị hỗn dịch tinh thể natri urat
Hòa tan 0,4 g (0,01 mol) natri hydroxid trong 400 ml nước cất. Thêm 1,68 g (0,01 mol) acid uric. Để qua đêm ở nhiệt độ phòng. Lọc hút chân không thu được tinh thể, rửa 3 lần bằng nước muối sinh lý lạnh. Tạo lại hỗn dịch bằng nước muối sinh lý và tiệt trùng trong nồi hấp. Hỗn dịch natri urat thu được cuối cùng có nồng độ 48 mg/ml.
34
Chuột cống trắng, giống đực được nuôi ổn định trong phòng thí nghiệm và được chia ngẫu nhiên thành 4 lô:
‒ Lô chứng: uống dung môi Na-CMC 0,5%.
‒ Lô đối chiếu: uống indomethacin liều 10 mg/kg pha trong Na-CMC 0,5%.
‒ Lô thử 1, 2: lần lượt uống cao hạt cần tây liều 250 mg/kg và 500 mg/kg pha trong Na-CMC 0,5%.
Thể tích cho chuột uống đều là 1 ml/100 g chuột. Trước khi dùng thuốc 1,5 giờ, chuột không được ăn nhưng được uống nước bình thường. Ngày thứ 5, sau khi uống dung môi, thuốc đối chiếu và chế phẩm thử 1 giờ, chuột được tiêm 0,05 ml hỗn dịch natri urat (nồng độ 48 mg/ml) vào khớp gối sau trái.
Quan sát biểu hiện di chuyển của từng chuột trên mặt phẳng tại các thời điểm 4, 5, 6 giờ sau khi tiêm, ghi lại hình ảnh bằng máy quay để hỗ trợ nhận định khi cần thiết. Vào ngày quan sát, chuột ở các lô vẫn được uống dung môi, thuốc đối chiếu và chế phẩm thử tương ứng vào đúng giờ qui định.
Kỹ thuật tiêm vào khớp gối
Gập khớp gối sau trái của động vật, xác định vị trí lõm trên khớp gối, đưa kim nhẹ nhàng vào thẳng trong khớp.
Thông số đánh giá
Sử dụng bảng 2.2 để đánh giá mức độ viêm dựa trên triệu chứng.
Bảng 2.2. Thang điểm đánh giá mức độ viêm dựa trên triệu chứng
Triệu chứng Mô tả Điểm
Không thể hiện rõ triệu chứng
Chuột không có hoặc không thể hiện rõ biểu
hiện di chuyển bất thường 1
Đi khập khiễng Chuột đi tập tễnh trong toàn bộ thời gian di
chuyển, chân có khớp bị đau vẫn tham gia vào quá trình di chuyển
2
Đi bằng 3 chân không liên tục
Chuột đi tập tễnh nhưng thỉnh thoảng chân có
35
Các quan sát viên được huấn luyện cách quan sát và thống nhất cách đánh giá trước khi làm thực nghiệm chính thức. Kết quả cuối cùng được ghi nhận từ quan sát của 3 quan sát viên độc lập và áp dụng phương pháp cho điểm mù.
2.3.2.2. Đánh giá tác dụng giảm đau ngoại vi theo phương pháp gây quặn đau bằng acid acetic
Áp dụng phương pháp gây quặn đau bằng acid acetic (phương pháp Koster) [48], [85].
Sử dụng dung dịch acid acetic 1% tiêm màng bụng làm chất gây đau. Thuốc đối chiếu là indomethacin 10 mg/kg.
Thiết kế thí nghiệm
Chuột nhắt trắng, giống đực được nuôi ổn định trong phòng thí nghiệm và được chia ngẫu nhiên thành 4 lô:
‒ Lô chứng: uống dung môi Na-CMC 0,5%.
‒ Lô đối chiếu: uống indomethacin liều 10 mg/kg pha trong Na-CMC 0,5%.
‒ Lô thử 1, 2: lần lượt uống cao hạt cần tây liều 250 mg/kg và 500 mg/kg pha trong Na-CMC 0,5%.
Thể tích cho chuột uống đều là 0,1 ml/10 g chuột. Trước khi dùng thuốc 1,5 giờ, chuột không được ăn nhưng được uống nước bình thường. Ngày thứ 5, sau khi uống dung môi, thuốc đối chiếu và chế phẩm thử 2 giờ, chuột được tiêm màng bụng 0,2 ml dung dịch acid acetic 1%.
Đặt mỗi chuột vào một chậu thủy tinh và đếm số cơn quặn đau trong mỗi 5 phút, liên tục cho đến hết phút thứ 30 sau khi tiêm dung dịch acid acetic 1%.
Biểu hiện của cơn quặn đau là bụng kéo căng và ít nhất một chân duỗi ra. Qui trình tiến hành thí nghiệm được mô tả trong hình 2.12.
di chuyển, phải kéo lê hoặc co chân Đi hoàn toàn bằng 3
chân
Chân có khớp bị đau không thể tham gia vào quá trình di chuyển, không thể cử động khớp bị viêm, phải kéo lê hoặc co chân
36
Thông số đánh giá
Số cơn quặn đau trong 5 phút liên tục từ khi bắt đầu tiêm acid acetic 1% cho đến hết phút thứ 30 của từng chuột.
Hình 2.12. Qui trình đánh giá tác dụng giảm đau ngoại vi theo phƣơng pháp gây quặn đau bằng acid acetic 2.3.3. Xác định độc tính cấp
Thiết kế thí nghiệm
Thử nghiệm được tiến hành trên chuột nhắt trắng, giống cái. Chuột được nuôi ổn định trong điều kiện phòng thí nghiệm.
Chia chuột thành các lô, cho chuột trong các lô uống cao hạt cần tây pha trong Na-CMC 0,5% với các liều tăng dần. Theo dõi chuột trong vòng 4 - 6 giờ đầu, số chuột chết trong vòng 72 giờ và tiếp tục theo dõi 7 ngày sau khi uống thuốc.
Chỉ tiêu theo dõi
‒ Tình trạng chung của chuột: các hoạt động tự nhiên, tư thế, màu sắc (lông, niêm
mạc, mắt, mũi, tai, đuôi …), phân, nước tiểu, hiện tượng tiêu chảy…, sự tiêu thụ thức ăn, nước uống.
‒ Xác định tỉ lệ động vật chết ở các lô trong vòng 72 giờ và tiếp tục theo dõi đến
ngày thứ 7 sau khi uống thuốc.
‒ Các động vật chết được mổ quan sát đại thể cơ quan, phủ tạng. Nếu cần có thể
37
‒ Xác định LD50 (nếu có) bằng phương pháp phân tích hồi qui Probit trên phần mềm SPSS 20.0.