2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phƣơng pháp đánh giá tác dụng hạ acid uric huyết thanh thực nghiệm nghiệm
2.3.1.1. Đánh giá khả năng hạ acid uric huyết thanh trên mô hình gây tăng acid uric cấp thực nghiệm bằng kali oxonat
Thiết kế thí nghiệm
27
‒ Lô chứng: uống dung môi pha thuốc Na-CMC 0,5%.
‒ Lô đối chiếu: uống allopurinol liều 10 mg/kg pha trong Na-CMC 0,5%.
‒ Lô thử 1, 2, 3: lần lượt uống cao hạt cần tây liều 250 mg/kg; 500 mg/kg và 1000 mg/kg pha trong Na-CMC 0,5%.
Qui trình thí nghiệm
Áp dụng mô hình gây tăng acid uric cấp thực nghiệm bằng cách tiêm kali oxonat màng bụng [7], [93].
tâm lấy huyết thanh để định lượng acid uric.
.500 - 4.0 - 200
trên máy sinh hóa TC - 3300 Plus (hình 2.6).
Qui trình thí nghiệm được mô tả ở hình 2.9.
Hình 2.9. Qui trình thí nghiệm đánh giá tác dụng hạ acid uric máu trên mô hình gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonat
28
Thông số đánh giá
‒ Nồng độ acid uric trong huyết thanh chuột thí nghiệm.
‒ Tỷ lệ giảm nồng độ acid huyết thanh của lô thử so với lô chứng.
Trong đó:
Cc, Ct: nồng độ acid uric huyết thanh của lô chứng, lô thử.
I (%): tỷ lệ giảm nồng độ acid uric huyết thanh của lô thử so với lô chứng.
2.3.1.2. Đánh giá khả năng ức chế enzym xanthin oxidase
Hoạt độ enzym xanthin oxidase (XO) được xác định bằng phương pháp đo quang dựa trên phản ứng oxy hóa xanthin thành acid uric có sự xúc tác của enzym xanthin oxidase:
Hoạt độ XO tỷ lệ với lượng acid uric định lượng được bằng phương pháp đo quang ở bước sóng 290 nm [8], [63], [62].
Đánh giá khả năng ức chế XO in vitro Thiết kế thí nghiệm
Thí nghiệm được thực hiện trên đĩa UV 96 giếng đáy phẳng Costar 3635 (Corning). Đo độ hấp thụ ở 290 nm trên hệ thống ELISA theo phương pháp của Noro T. trong ống nghiệm [63] và Nguyễn T.M. trên đĩa 96 giếng [62], có sự điều chỉnh cho phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm.
Ba mẫu cao hạt cần tây chiết xuất theo 3 qui trình (QT1, QT2, QT3) được thử
tác dụng ức chế XO in vitro ở nồng độ 100 µg/ml để tìm ra qui trình có khả năng ức
chế XO in vitro mạnh nhất. Mỗi mẫu được tiến hành thử 3 lần, mỗi lần thử 3 giếng.
29
Song song với mỗi mẫu chứng, mẫu thử có một mẫu trắng của chứng, mẫu trắng của thử. Các mẫu trắng được tiến hành tương tự nhưng thay đổi trình tự cho enzym vào giếng (enzym được cho vào sau HCl 1N).
Thành phần trong mẫu chứng và mẫu thử được thể hiện ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Thành phần mẫu chứng và mẫu thử Thành phần Mẫu chứng Mẫu thử Dung dịch thử 0 50μl Dung dịch đệm phosphat pH 7,5 85μl 35μl Xanthin 150Μm 60μl 60μl Enzym XO 0,01U/ml 30μl 30μl HCl 1M 25μl 25μl Tổng thể tích 200μl 200μl
Qui trình thí nghiệm được mô tả ở hình 2.10.
30 Thông số đánh giá ‒ ∆OD: độ hấp thụ quang ∆ODchứng = ODchứng – ODtrắng chứng ∆ODthử = ODthử – ODtrắng thử ‒ I (%) ức chế tính theo công thức:
Trong đó: ∆ODchứng: độ hấp thụ quang của các mẫu ở lô chứng
∆ODthử: độ hấp thụ quang của các mẫu ở lô thử.
∆ODtrắng chứng: độ hấp thụ quang của các mẫu ở lô trắng của chứng ∆ODtrắng thử: độ hấp thụ quang của các mẫu ở lô trắng của thử.
Đánh giá khả năng ức chế XO in vivo Thiết kế thí nghiệm
Áp dụng mô hình đánh giá ảnh hưởng lên hoạt độ XO của gan chuột thực nghiệm [46], [61].
Chuột nhắt trắng, đực, trưởng thành được nuôi ổn định trong phòng thí nghiệm và chia ngẫu nhiên thành 4 lô:
‒ Lô chứng: uống dung môi Na-CMC 0,5%.
‒ Lô đối chiếu: uống allopurinol liều 10 mg/kg pha trong Na-CMC 0,5%.
‒ Lô thử 1, 2: lần lượt uống cao hạt cần tây liều 250 mg/kg và 500 mg/kg pha trong Na-CMC 0,5%.
Chuột được uống dung môi pha thuốc, thuốc đối chiếu hoặc chế phẩm thử với cùng thể tích 0,1 ml/10 g vào một giờ nhất định trong vòng 5 ngày trước khi làm thực nghiệm. Trước khi dùng dung môi hoặc thuốc 1,5 giờ, chuột không được ăn nhưng được uống nước bình thường.
tiến hành cắt gan chuột để chiết enzym gan.
31
Ảnh hưởng của cao hạt cần tây lên hoạt độ xanthin oxidase trên gan chuột thực nghiệm sẽ được đánh giá thông qua sự biến thiên độ hấp thụ quang (OD) của acid uric - sản phẩm được tạo ra trong phản ứng giữa cơ chất xanthin với enzym xanthin oxidase được chiết ra từ gan chuột của lô thử so với lô chứng.
Phương pháp chiết enzym
Kết thúc thực nghiệm, giết chuột bằng cách kéo dãn đốt sống cổ, lấy ngay gan từng chuột. Cân khoảng 1 g gan, cắt thành các mảnh nhỏ, cho vào ống nghiền đồng thể đã để lạnh và có sẵn 1 ml dung dịch đệm phosphat lạnh (pH = 7,5). Nghiền gan trong điều kiện lạnh đến khi thu được dịch đồng thể, sau đó thêm dần đệm lạnh để thu được dịch đồng thể với tỷ lệ (gan : đệm) tương ứng là (1 : 10). Dịch nghiền
thu được đem ly tâm lạnh ở 00C với tốc độ 3.000 vòng trong 10 phút. Lấy phần dịch
nổi tiếp tục đem ly tâm lạnh ở 00C với tốc độ 10.000 vòng trong 60 phút. Phần dịch
trong thu được sau khi ly tâm dùng để xác định hoạt độ enzym. Toàn bộ các bước của thí nghiệm được thực hiện trong điều kiện lạnh (môi trường nước đá đang tan) [8], [61].
Phản ứng enzym
Phản ứng được thực hiện trong ống nghiệm gồm: 2,9 ml đệm phosphat (0,05M, pH = 7,5); 2,5 ml dung dịch đệm cơ chất (gồm xanthin 0,12mM; EDTA 0,192mM; kali oxonat 2,2mM). Trước khi phản ứng, dịch enzym và cơ chất
được ủ ở 370C trong 15 phút. Thời gian phản ứng được tính từ lúc thêm 0,1 ml dịch
enzym vào dung dịch cơ chất. Tiếp tục ủ trong 30 phút. Hút 200 μl dịch sau phản ứng ra đĩa Costar 96 giếng để tiến hành đo quang ở bước sóng 290 nm.
Song song tiến hành với mẫu trắng gồm có: 5,4 ml đệm phosphat pH 7,5 + 0,1 ml enzym [28], [51].
Thông số đánh giá
Tương tự phần Thông số đánh giá của thí nghiệm Đánh giá khả năng ức chế
XO in vitro ở mục 2.3.1.2.