* Định lượng
Để định lượng hàm lượng DC trong viên nén bào chế chúng tôi phát triển phương pháp đo quang phổ hấp thụ tử ngoại ở bước sóng 272 nm và phương pháp HPLC. Trong đó, phương pháp đo quang phổ hấp thụ tử ngoại ở bước sóng 272 nm được dùng để đánh giá khả năng GPDC trong môi trường nước, phương pháp HPLC được dùng để đánh giá độ ổn định của DC trong môi trường dung dịch HCl pH 1,2. - Phương pháp đo quang phổ hấp thụ tử ngoại: Hàm lượng AMOX trong viên được xác định bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ tử ngoại ở bước sóng 272 nm.
22
Điều kiện sắc ký
+ Cột sắc ký: Cột ZORBAX Eclipse XDB - CN kích thước cột 4,6 × 150 mm, đường kính hạt nhồi 5 µm, bảo vệ cột ZORBAX XDB - CN (4,6×12,5 mm, 5 µm).
+ Pha động: dung dịch đệm phosphat pH 5,0 : acetonitril (95:5). + Tốc độ dòng: 0,5 mL/phút.
+ Thể tích tiêm mẫu: 20 µL. + Detector UV bước sóng 230 nm.
Mẫu chuẩn
Cân chính xác 120 mg bột AMOX, hòa tan hoàn toàn bằng dung dịch đệm phosphat pH 5,0 trong bình định mức 100 mL, bổ sung vừa đủ thể tích, thu được dung dịch gốc nồng độ 1,2 mg/mL.
Tiếp tục pha loãng dung dịch gốc 20 lần với dung dịch đệm phosphat pH 5,0 để thu được mẫu chuẩn có nồng độ khoảng 60 µg/mL. Lọc qua màng lọc 0,45 µm. Sau đó tiêm mẫu vào cột và chạy HPLC.
Mẫu thử
Cân 20 viên, tính khối lượng trung bình, nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lượng bột tương ứng khoảng 0,2 g AMOX cho vào bình định mức 200 mL, thêm dung dịch đệm phosphat pH 5,0 siêu âm 15 phút, thêm dung dịch đệm phosphat pH 5,0 vừa đủ đến vạch. Lọc qua màng lọc 0,45 m. Sau đó tiêm mẫu vào cột và chạy HPLC.
Cách tính kết quả: % AMOX = 𝑆𝑡ℎ ử 𝑆𝑐ℎ 𝑢 ẩ𝑛 × 𝑚𝑐ℎ 𝑢 ẩ𝑛 𝑚𝑡ℎ ử × 𝐹𝑡ℎ ử 𝐹𝑐ℎ 𝑢 ẩ𝑛 × 𝑚𝑡𝑏 𝐻𝐿 × 𝐾ℎ𝑐 Trong đó:
Schuẩn, Sthử: Diện tích pic trên sắc ký đồ mẫu chuẩn, mẫu thử. mchuẩn, mthử: Khối lượng chất chuẩn, chất thử (mg).
mtb: Khối lượng trung bình của viên (mg).
Fchuẩn, Fthử: Độ pha loãng của mẫu chuẩn, mẫu thử. HL: Hàm lượng (250 mg).
23
* Khả năng kết dính sinh học in vitro [27]
Nguyên tắc: Xác định lực KDSH bằng lực tách rời viên thuốc ra khỏi bề mặt niêm
mạc dạ dày thỏ.
Phương pháp xử lý niêm mạc dạ dày thỏ: Bơm không khí vào tĩnh mạch vành tai để
làm chết thỏ. Ngay lập tức phẫu thuật cắt lấy dạ dày thỏ. Làm sạch bề mặt niêm mạc dạ dày bằng dung dịch nước muối sinh lý sao cho không làm mất lớp chất nhày trên bề mặt. Cắt thành những mảnh niêm mạc diện tích 4 cm2 (2 × 2 cm) và tiến hành làm thí nghiệm ngay sau đó.
Thiết bị: Thiết bị đánh giá lực kết dính sinh học được mô tả ở hình 2.5.
Tiến hành: Gắn cố định niêm mạc dạ dày thỏ đã được xử lý lên giá, làm ướt dạ dày
bằng một thể tích chính xác dung dịch HCl pH 1,2. Gắn cố định viên thuốc lên mặt dưới của đĩa cân bên phải, đĩa cân bên trái đặt 1 chiếc cốc nhựa khô, thăng bằng cân. Sau đó tác động lên viên thuốc một lực 200 g trong khoảng thời gian 1 phút. Điều chỉnh nước nhỏ xuống cốc nhựa với tốc độ 3 mL/phút cho đến khi viên thuốc bị kéo chuyển dịch dưới tác động của trọng lượng nước. Cân cốc nước để xác định lực KDSH của viên thuốc. Lực KDSH tính cho 1 cm2
được tính như sau: F (N/cm2) = 0,00981×𝑚
𝑆
Trong đó:
F: Lực KDSH của viên thuốc m: Khối lượng nước
S: Diện tích bề mặt viên thuốc (cm2) được quét hình ảnh và xác định bằng phần mềm Image J1.46
24
Hình 2.5. Thiết bị đánh giá lực KDSH chế tạo từ cân Roberval [7], [9].
* Đánh giá tốc độ hòa tan của viên nén amoxicillin kết dính sinh học
Khả năng GPDC của viên AMOX bào chế được tiến hành trong điều kiện tham khảo USP 36 như sau [48]:
- Thiết bị: cánh khuấy.
- Tốc độ khuấy: 75 ± 1 vòng/phút. - Môi trường hòa tan: 900 mL nước cất. - Nhiệt độ môi trường hòa tan: 37 ± 0,50C.
- Thời gian thử nghiệm: 5 giờ và lấy mẫu vào các thời điểm: 1 giờ, 3 giờ, 5 giờ. - Lấy mẫu: hút 10 mL mẫu, bổ sung lại 10 mL môi trường sau mỗi lần lấy mẫu. - Định lượng bằng phương pháp đo mật độ quang ở bước sóng λ= 272 nm. - Cách tính kết quả:
Nồng độ AMOX chưa hiệu chỉnh ở lần hút thứ n:
Cn0 =Dn0 × C0 D0 × α
Trong đó:
Dn0: Độ hấp thụ của dung dịch thử C0: Nồng độ dung dịch chuẩn (µg/mL) D0: Độ hấp thụ của dung dịch chuẩn α: Độ pha loãng (α = 10)
25
Nồng độ AMOX sau khi hiệu chỉnh trong mẫu ở lần hút thứ n được tính:
Cn = 𝐶𝑛0 × α +V0 V × 𝐶𝑖 n−1 i=1 Trong đó: Cn: Nồng độ hiệu chỉnh ở lần hút thứ n (µg/mL) Cn0: Nồng độ chưa hiệu chỉnh ở lần hút thứ n (µg/mL) V0: Thể tích dịch hòa tan đã hút (V0= 10 mL)
V: Thể tích môi trường hòa tan (V = 900 mL)
Ci: Nồng độ chưa hiệu chỉnh ở lần hút thứ i (µg/mL)
Phần trăm AMOX (C%) hòa tan tại thời điểm n được tính theo công thức:
C% = Cn × 900
1000 × m× 100
Trong đó:
Cn: Nồng độ hiệu chỉnh ở lần hút thứ n m: Lượng AMOX trong mẫu (mg)
Yêu cầu phần trăm AMOX giải phóng theo thời gian (tham khảo USP 36) được trình bày trong bảng 2.6.
Bảng 2.6. Yêu cầu phần trăm AMOX giải phóng theo thời gian (USP 36). Thời gian (giờ) Phần trăm AMOX giải phóng (%)
1 50 – 65
3 65 – 85
5 > 85
* Khả năng hút nước
Khả năng hút nước của viên nén bào chế được xác định bằng cách tính khối lượng nước được hấp thụ vào trong viên: Viên thuốc được cho vào giỏ làm bằng thép không gỉ có kích thước mắt lưới 381 μm, đường kính sợi dây là 254 µm và cân xác định khối lượng ban đầu (W0). Sau đó giỏ thuốc được nhúng vào trong 100 mL dung dịch HCl pH 1,2 ở nhiệt độ 370C.
26
Sau từng khoảng thời gian nhất định (10 phút) giỏ thuốc được lấy ra, dùng giấy lọc thấm hết phần nước trên bề mặt viên và cân xác định khối lượng (Wt). Khả năng hút nước của viên thuốc (S) được xác định theo công thức [47]:
S (%) = 𝑊𝑡−𝑊0
𝑊0 ×100
* Các đánh giá khác: Hình thức viên, lực gây vỡ viên được thực hiện theo yêu cầu
chuyên luận của DĐVN IV [4].