- Cân kỹ thuật SARTORIUS.
- Cân phân tích SARTORIUS có độ chính xác 0,1 mg. - Tủ sấy BINDER, HERAEUS.
- Máy siêu âm ULTRASONIC LC 60H. - Thiết bị trộn lập phương ERWEKA. - Máy dập viên tâm sai.
- Máy hút ẩm EDISON ED – 12B.
- Máy đo độ bền cơ học của viên ERWEKA - TBH 200. - Máy đo độ ẩm SARTORIUS.
- Máy đo khối lượng riêng biểu kiến ERWEKA - SVM. - Máy đo độ trơn chảy ERWEKA - GWF.
- Máy đo pH EUTECH INSTRUMENTS pH 510. - Máy thử hòa tan ERWEKA DT 600.
- Máy đo quang phổ UV - VIS HITACHI U1800. - Máy lọc nén.
- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HP1260 ALIGENT. - Thiết bị đánh giá khả năng KDSH tự chế tạo từ cân kỹ thuật. - Tủ vi khí hậu CLIMACELL.
- Micropipet và các dụng cụ thuỷ tinh. - Rây 180, 250 m.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp bào chế viên nén amoxicilin kết dính sinh học
Bào chế viên nén AMOX KDSH bằng phương pháp dập thẳng với các thành phần: - Dược chất: amoxicilin 250 mg.
- Polyme KDSH: Polyox WSR Coagulant, Polyox WSR - 303, HPMC K100M, HPMC K4M, Na alginat, chitosan.
- Tá dược độn: lactose, Avicel PH101.
- Tá dược trơn, bóng: magnesi stearat, talc, natri laurylsulfat.
20
Các bước tiến hành bào chế viên nén AMOX được thể hiện trong hình 2.3.
Hình 2.4. Sơ đồ các bƣớc bào chế viên nén AMOX KDSH
2.2.2. Đánh giá chất lượng bột trước khi dập viên
* Xác định khối lượng riêng biểu kiến và chỉ số nén của khối bột.
Thể tích biểu kiến của khối bột được đo trên máy ERWEKA SVM. Một lượng bột có khối lượng xác định (m) được cho vào ống đong thể tích hình trụ. Thể tích khối bột ban đầu là V0. Sau đó ống đong được gõ cho đến khi thể tích không thay đổi thì
đọc thể tích cuối cùng là V.
Khối lượng riêng của khối bột ban đầu: d0 = 𝑚
𝑉0(g/cm3). Khối lượng riêng biểu kiến của khối bột sau khi gõ: d = 𝑚
𝑉 (g/cm3). Chỉ số nén của khối bột: Carr’s (%) = 𝑉0−𝑉
𝑉0 ×100
Mối liên quan giữa chỉ số nén Carr’s và đặc tính trơn chảy của khối bột kép được trình bày trong bảng 2.5.
Chuẩn bị dược chất, tá dược Rây # 250, cân
Trộn bột kép Chuẩn bị tá dược trơn
Trộn đều Nghiền, rây # 180, cân
Dập viên
Khối lượng viên: 700mg
Lực gây vỡ viên: 11-14 kP Kích thước18 x 9 x 3 (mm)
21
Bảng 2.5. Mối liên quan giữa chỉ số nén Carr’s và đặc tính trơn chảy của khối bột kép [18].
Chỉ số nén Carr’s (%) Đặc tính trơn chảy
≤ 10 Trơn chảy rất tốt
11 – 15 Trơn chảy tốt
16 – 20 Trơn chảy tương đối tốt
26 – 31 Trơn chảy kém
≥ 32 Trơn chảy rất kém
* Xác định độ trơn chảy.
Tốc độ chảy của khối bột được đo trên máy ERWEKA GWF, với đường kính lỗ phễu 12 mm. Tốc độ chảy được tính theo công thức:
V = tgφ Trong đó:
V: tốc độ chảy (g/giây)
φ: góc giữa đường thẳng biểu diễn sự phụ thuộc của khối lượng bột chảy theo thời gian và trục hoành (trục thời gian).
* Xác định hàm ẩm theo phương pháp mất khối lượng do sấy khô.
Tiến hành trên cân xác định độ ẩm nhanh SARTORIUS. Cân chính xác khoảng 1g bột, rải đều vào đĩa cân, đặt nhiệt độ 105°C, theo dõi và đọc kết quả.
2.2.3. Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của viên nén
* Định lượng
Để định lượng hàm lượng DC trong viên nén bào chế chúng tôi phát triển phương pháp đo quang phổ hấp thụ tử ngoại ở bước sóng 272 nm và phương pháp HPLC. Trong đó, phương pháp đo quang phổ hấp thụ tử ngoại ở bước sóng 272 nm được dùng để đánh giá khả năng GPDC trong môi trường nước, phương pháp HPLC được dùng để đánh giá độ ổn định của DC trong môi trường dung dịch HCl pH 1,2. - Phương pháp đo quang phổ hấp thụ tử ngoại: Hàm lượng AMOX trong viên được xác định bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ tử ngoại ở bước sóng 272 nm.
22
Điều kiện sắc ký
+ Cột sắc ký: Cột ZORBAX Eclipse XDB - CN kích thước cột 4,6 × 150 mm, đường kính hạt nhồi 5 µm, bảo vệ cột ZORBAX XDB - CN (4,6×12,5 mm, 5 µm).
+ Pha động: dung dịch đệm phosphat pH 5,0 : acetonitril (95:5). + Tốc độ dòng: 0,5 mL/phút.
+ Thể tích tiêm mẫu: 20 µL. + Detector UV bước sóng 230 nm.
Mẫu chuẩn
Cân chính xác 120 mg bột AMOX, hòa tan hoàn toàn bằng dung dịch đệm phosphat pH 5,0 trong bình định mức 100 mL, bổ sung vừa đủ thể tích, thu được dung dịch gốc nồng độ 1,2 mg/mL.
Tiếp tục pha loãng dung dịch gốc 20 lần với dung dịch đệm phosphat pH 5,0 để thu được mẫu chuẩn có nồng độ khoảng 60 µg/mL. Lọc qua màng lọc 0,45 µm. Sau đó tiêm mẫu vào cột và chạy HPLC.
Mẫu thử
Cân 20 viên, tính khối lượng trung bình, nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lượng bột tương ứng khoảng 0,2 g AMOX cho vào bình định mức 200 mL, thêm dung dịch đệm phosphat pH 5,0 siêu âm 15 phút, thêm dung dịch đệm phosphat pH 5,0 vừa đủ đến vạch. Lọc qua màng lọc 0,45 m. Sau đó tiêm mẫu vào cột và chạy HPLC.
Cách tính kết quả: % AMOX = 𝑆𝑡ℎ ử 𝑆𝑐ℎ 𝑢 ẩ𝑛 × 𝑚𝑐ℎ 𝑢 ẩ𝑛 𝑚𝑡ℎ ử × 𝐹𝑡ℎ ử 𝐹𝑐ℎ 𝑢 ẩ𝑛 × 𝑚𝑡𝑏 𝐻𝐿 × 𝐾ℎ𝑐 Trong đó:
Schuẩn, Sthử: Diện tích pic trên sắc ký đồ mẫu chuẩn, mẫu thử. mchuẩn, mthử: Khối lượng chất chuẩn, chất thử (mg).
mtb: Khối lượng trung bình của viên (mg).
Fchuẩn, Fthử: Độ pha loãng của mẫu chuẩn, mẫu thử. HL: Hàm lượng (250 mg).
23
* Khả năng kết dính sinh học in vitro [27]
Nguyên tắc: Xác định lực KDSH bằng lực tách rời viên thuốc ra khỏi bề mặt niêm
mạc dạ dày thỏ.
Phương pháp xử lý niêm mạc dạ dày thỏ: Bơm không khí vào tĩnh mạch vành tai để
làm chết thỏ. Ngay lập tức phẫu thuật cắt lấy dạ dày thỏ. Làm sạch bề mặt niêm mạc dạ dày bằng dung dịch nước muối sinh lý sao cho không làm mất lớp chất nhày trên bề mặt. Cắt thành những mảnh niêm mạc diện tích 4 cm2 (2 × 2 cm) và tiến hành làm thí nghiệm ngay sau đó.
Thiết bị: Thiết bị đánh giá lực kết dính sinh học được mô tả ở hình 2.5.
Tiến hành: Gắn cố định niêm mạc dạ dày thỏ đã được xử lý lên giá, làm ướt dạ dày
bằng một thể tích chính xác dung dịch HCl pH 1,2. Gắn cố định viên thuốc lên mặt dưới của đĩa cân bên phải, đĩa cân bên trái đặt 1 chiếc cốc nhựa khô, thăng bằng cân. Sau đó tác động lên viên thuốc một lực 200 g trong khoảng thời gian 1 phút. Điều chỉnh nước nhỏ xuống cốc nhựa với tốc độ 3 mL/phút cho đến khi viên thuốc bị kéo chuyển dịch dưới tác động của trọng lượng nước. Cân cốc nước để xác định lực KDSH của viên thuốc. Lực KDSH tính cho 1 cm2
được tính như sau: F (N/cm2) = 0,00981×𝑚
𝑆
Trong đó:
F: Lực KDSH của viên thuốc m: Khối lượng nước
S: Diện tích bề mặt viên thuốc (cm2) được quét hình ảnh và xác định bằng phần mềm Image J1.46
24
Hình 2.5. Thiết bị đánh giá lực KDSH chế tạo từ cân Roberval [7], [9].
* Đánh giá tốc độ hòa tan của viên nén amoxicillin kết dính sinh học
Khả năng GPDC của viên AMOX bào chế được tiến hành trong điều kiện tham khảo USP 36 như sau [48]:
- Thiết bị: cánh khuấy.
- Tốc độ khuấy: 75 ± 1 vòng/phút. - Môi trường hòa tan: 900 mL nước cất. - Nhiệt độ môi trường hòa tan: 37 ± 0,50C.
- Thời gian thử nghiệm: 5 giờ và lấy mẫu vào các thời điểm: 1 giờ, 3 giờ, 5 giờ. - Lấy mẫu: hút 10 mL mẫu, bổ sung lại 10 mL môi trường sau mỗi lần lấy mẫu. - Định lượng bằng phương pháp đo mật độ quang ở bước sóng λ= 272 nm. - Cách tính kết quả:
Nồng độ AMOX chưa hiệu chỉnh ở lần hút thứ n:
Cn0 =Dn0 × C0 D0 × α
Trong đó:
Dn0: Độ hấp thụ của dung dịch thử C0: Nồng độ dung dịch chuẩn (µg/mL) D0: Độ hấp thụ của dung dịch chuẩn α: Độ pha loãng (α = 10)
25
Nồng độ AMOX sau khi hiệu chỉnh trong mẫu ở lần hút thứ n được tính:
Cn = 𝐶𝑛0 × α +V0 V × 𝐶𝑖 n−1 i=1 Trong đó: Cn: Nồng độ hiệu chỉnh ở lần hút thứ n (µg/mL) Cn0: Nồng độ chưa hiệu chỉnh ở lần hút thứ n (µg/mL) V0: Thể tích dịch hòa tan đã hút (V0= 10 mL)
V: Thể tích môi trường hòa tan (V = 900 mL)
Ci: Nồng độ chưa hiệu chỉnh ở lần hút thứ i (µg/mL)
Phần trăm AMOX (C%) hòa tan tại thời điểm n được tính theo công thức:
C% = Cn × 900
1000 × m× 100
Trong đó:
Cn: Nồng độ hiệu chỉnh ở lần hút thứ n m: Lượng AMOX trong mẫu (mg)
Yêu cầu phần trăm AMOX giải phóng theo thời gian (tham khảo USP 36) được trình bày trong bảng 2.6.
Bảng 2.6. Yêu cầu phần trăm AMOX giải phóng theo thời gian (USP 36). Thời gian (giờ) Phần trăm AMOX giải phóng (%)
1 50 – 65
3 65 – 85
5 > 85
* Khả năng hút nước
Khả năng hút nước của viên nén bào chế được xác định bằng cách tính khối lượng nước được hấp thụ vào trong viên: Viên thuốc được cho vào giỏ làm bằng thép không gỉ có kích thước mắt lưới 381 μm, đường kính sợi dây là 254 µm và cân xác định khối lượng ban đầu (W0). Sau đó giỏ thuốc được nhúng vào trong 100 mL dung dịch HCl pH 1,2 ở nhiệt độ 370C.
26
Sau từng khoảng thời gian nhất định (10 phút) giỏ thuốc được lấy ra, dùng giấy lọc thấm hết phần nước trên bề mặt viên và cân xác định khối lượng (Wt). Khả năng hút nước của viên thuốc (S) được xác định theo công thức [47]:
S (%) = 𝑊𝑡−𝑊0
𝑊0 ×100
* Các đánh giá khác: Hình thức viên, lực gây vỡ viên được thực hiện theo yêu cầu
chuyên luận của DĐVN IV [4].
2.2.4. Phương pháp nghiên cứu độ ổn định
2.2.4.1. Phương pháp đánh giá độ ổn định của dược chất trong môi trường dung dịch acid clohydric pH 1,2
a. Đánh giá độ ổn định của hạt compact amoxicilin nguyên liệu trong môi trường dung dịch acid clohydric pH 1,2:
Tiến hành: Hòa tan 250,25 mg hạt compact AMOX (hàm lượng AMOX 99,9%)
trong 900 mL dung dịch HCl pH 1,2 và duy trì nhiệt độ 370C. Tại các thời điểm 0, 1, 3, 5 giờ hút chính xác 5 mL dung dịch trên thêm vừa đủ 50 mL bằng dung dịch đệm phosphat pH 5,0. Lọc qua màng lọc 0,45 µm. Tiêm mẫu vào cột và chạy HPLC. Thí nghiệm được tiến hành 3 lần lấy kết quả trung bình [31], [38].
Mẫu chuẩn: Cân chính xác 120 mg bột AMOX, hòa tan hoàn toàn bằng dung dịch
đệm phosphat pH 5,0 trong bình định mức 100 mL, bổ sung vừa đủ thể tích, thu được dung dịch gốc nồng độ 1,2 mg/mL. Tiếp tục pha loãng dung dịch gốc 20 lần với dung dịch đệm phosphat pH 5,0 để thu được mẫu chuẩn có nồng độ khoảng 60 µg/mL. Lọc qua màng lọc 0,45 µm. Tiêm mẫu vào cột và chạy HPLC.
Cách tính kết quả (tương tự như trình bày ở mục 2.2.3)
b. Đánh giá độ ổn định viên nén bào chế trong môi trường dung dịch acid clohydric pH 1,2:
- Thiết bị: cánh khuấy.
- Tốc độ khuấy: 75 ± 1 vòng/phút.
- Môi trường: 900 mL dung dịch HCl pH 1,2.
- Thời gian thử nghiệm: 5 giờ và lấy mẫu vào các thời điểm: 1 giờ, 3 giờ, 5 giờ - Nhiệt độ 37 ± 0,50C.
27
- Cho 3 viên thử nghiệm vào 3 cốc thử hòa tan. Tiến hành xác định hàm lượng DC giải phóng trong môi trường dung dịch HCl pH 1,2 và hàm lượng DC còn lại trong viên như sau:
Xác định hàm lượng dược chất giải phóng trong môi trường dung dịch HCl pH 1,2: Hút chính xác 5 mL dung dịch trong cốc thử hòa tan vào bình định mức 50 mL, thêm dung dịch đệm phosphat pH 5,0 vừa đủ tới vạch. Lọc qua màng 0,45 µm. Tiêm mẫu vào cột và chạy HPLC. Xác định hàm lượng dược chất bằng phương pháp HPLC (tương tự như trình bày ở mục 2.2.3)
Xác định hàm lượng dược chất còn lại trong viên: Vớt viên trong cốc thử hòa tan, cho viên vào cốc có mỏ 200 mL chứa khoảng 100 mL dung dịch đệm phosphat pH 5,0 siêu âm hòa tan viên. Cho hỗn hợp thu được vào bình định mức 200 mL, thêm dung dịch đệm phosphat pH 5,0 vừa đủ tới vạch. Hút chính xác 5 mL dung dịch trên vào bình định mức 50 mL thêm dung dịch đệm phosphat pH 5,0 vừa đủ tới vạch. Lọc qua màng 0,45 µm. Tiêm mẫu vào cột và chạy HPLC. Tiến hành xác định hàm lượng DC trong viên bằng phương pháp HPLC (tương tự như trình bày ở mục 2.2.3).
Hàm lượng dược chất còn lại trong từng thời điểm được tính dựa trên tổng hàm lượng dược chất giải phóng trong môi trường dung dịch HCl pH 1,2 và hàm lượng dược chất còn lại trong viên nén.
2.2.4.2. Phương pháp đánh giá độ ổn định của chế phẩm
- Đối tượng nghiên cứu: 3 lô × 500 viên nén AMOX bào chế theo công thức tối ưu lựa chọn được đóng lọ HDPE có đậy nắp kín.
- Điều kiện bảo quản:
+ Điều kiện thực: 1 tháng.
+ Lão hóa cấp tốc: nhiệt độ 40 ± 20C, độ ẩm 75 ± 5% trong 1 tháng.
- Các chỉ tiêu chất lượng khảo sát: hàm lượng AMOX, lực KDSH in vitro, độ hòa
tan.
2.2.5. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu
- Xác định diện tích bề mặt viên trong khả năng KDSH in vitro bằng phần mềm
28 - Xử lý kết quả phân tích:
+ Tính giá trị trung bình:
+ Tính độ lệch chuẩn:
+ Tính độ lệch chuẩn tương đối:
Trong đó: n: số lần lặp lại thí nghiệm.
- Xác định phần trăm AMOX (%) phân huỷ theo thời gian (giờ) trong môi trường dung dịch HCl pH 1,2 bằng phần mềm Splus 8.0:
C = C0 .e-kt lnC = -kt + lnC0 Trong đó:
C0 : Phần trăm AMOX ban đầu (%). C: Phần trăm AMOX tại thời điểm t (%). t: Thời gian (giờ).
k: Hằng số tốc độ phân hủy của AMOX, có thể tính từ độ dốc của đường thẳng hồi quy. Hằng số tốc độ phân hủy của AMOX càng lớn thì khả năng phân hủy của AMOX trong môi trường dung dịch HCl pH 1,2 theo thời gian càng cao và ngược lại.
29
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ
3.1. Xây dựng phương pháp định lượng dược chất 3.1.1. Phương pháp đo quang phổ hấp thụ tử ngoại
Cân chính xác 100 mg AMOX cho vào bình định mức 100 mL, thêm 60 mL nước và siêu âm khoảng 30 phút để hòa tan hoàn toàn. Thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc đều và lọc. Sau đó pha loãng thành các dung dịch có nồng độ lần lượt 40, 60, 80, 100, 120, 140 µg/mL. Tiến hành đo mật độ quang các dung dịch trên ở bước sóng 272 nm. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.7 và hình 3.6
Bảng 3.7. Mật độ quang (D) và nồng độ C của dung dịch AMOX trong nƣớc. C
(µg/mL) 40 60 80 100 120 140
D 0,194 0,257 0,318 0,385 0,461 0,538
Hình 3.6. Đồ thị đƣờng chuẩn biểu thị mối tƣơng quan giữa mật độ quang (D) và nồng độ (C) của dung dịch AMOX trong nƣớc.
Nhận xét: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang (D) và nồng độ (C) của dung
dịch AMOX trong nước là đường thẳng với hệ số tương quan R2 xấp xỉ bằng 1, chứng tỏ mật độ quang phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ dung dịch AMOX trong
y = 0,0034x + 0,0504 R² = 0,9974 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 20 40 60 80 100 120 140 160 M ật đ ộ q u an g (D ) Nồng độ C (µg/mL)
30
khoảng khảo sát. Vì vậy, có thể sử dụng phương pháp đo quang phổ hấp thụ tử ngoại ở bước sóng 272 nm để định lượng hàm lượng AMOX giải phóng trong môi trường nước.
3.1.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao* Tính tương thích của hệ thống sắc kí