- Máy siêu âm Viber-cells VC 505 (Mỹ).
- Màng thẩm tích 10000 Dalton (Mỹ).
- Ống siêu ly tâm – lọc 10000 MWCO Milipore (Mỹ).
2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Xây dựng công thức và quy trình bào chế hệ tiểu phân nano polyme chứa artesunat sử dụng chất mang là PLGA, bao ngoài bằng chất diện hoạt mang điện tích dương DDAB để thay đổi điện thế bề mặt của tiểu phân.
- Gắn hyaluronic acid lên bề mặt tiểu phân với vai trò như một yếu tố hướng đích cho tiểu phân nano.
- Đánh giá các chỉ tiêu chất lượng của hệ tiểu phân bào chế được.
2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.4.1 Phương pháp bào chế
2.4.1.1 Phương pháp bào chế tiểu phân nano polyme artesunat.
Tiểu phân nano polyme được bào chế bằng phương pháp nhũ hóa bốc hơi dung môi. Sơ đồ quy trình được trình bày ở hình 2.1
Mô tả quy trình
- Chuẩn bị pha hữu cơ: Hòa tan dược chất ART, chất diện hoạt mang điện tích dương DDAB và polyme PLGA vào dung môi hữu cơ DCM.
- Chuẩn bị pha nước: Pha dung dịch Tween 80 1.5% trong nước.
- Giai đoạn nhũ hóa: Pha hữu cơ được nhỏ từ từ bằng micropipette vào pha nước với tốc độ 1 ml/phút. Đồng thời, hỗn hợp được hình thành bằng lực phân tán. Thiết
bị tạo lực phân tán sử dụng máy siêu âm cầm tay kết hợp cùng máy khuấy từ. Thông số máy siêu âm được cài đặt ở 20W trong 5 phút.
- Giai đoạn bốc hơi dung môi: hỗn dịch thu được được khuấy từ nhẹ trong 3 tiếng để bốc hơi hết lượng dung môi hữu cơ.
- Tinh chế và thu sản phẩm: hỗn dịch nano thu được mang đi ly tâm bằng ống siêu ly tâm – lọc với tốc độ 5000 vòng/phút trong 30 phút. Phần cắn thu được rửa với nước cất sau đó phân tán lại vào 20ml nước cất.
Pha nước
Tween 80 1.5%
Pha hữu cơ
(ART,PLGA,DDAB trong DCM)
Hệ dị thể
(tiểu phân nano, dược chất tự do, DDAB dư, chất diện hoạt)
Nhũ tương
Nhỏ giọt từ từ Lực phân tán cơ học
Khuấy từ trong 3h để bốc hơi dung môi
Hệ dị thể
(tiểu phân nano, dược chất tự do, DDAB dư, chất diện hoạt)
Ly tâm 5000 vòng/phút trong 30 phút
2.4.1.2 Phương pháp gắn hyaluronic acid lên bề mặt tiểu phân nano polyme artesunat
Phân tử Hyaluronic acid sẽ được gắn lên bề mặt tiểu phân nano nhờ lực liên kết tĩnh điện. Dung dịch hyaluronic acid trong nước với các nồng độ thay đổi sẽ được phối hợp với hỗn dịch nano với tỉ lệ thể tích 1:1. Dung dịch HA được nhỏ từ từ vào hỗn dịch nano trong bể siêu âm và được tiếp tục siêu âm trong 15 phút. Hỗn dịch sau đó được làm mát để cho các bước đánh giá tiếp theo. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.4.2 Các phương pháp đánh giá
2.4.2.1 Phương pháp định lượng artesunat bằng phương pháp HPLC
Xác định hàm lượng ART trong hệ chất mang nano polyme bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao. Các điều kiện sắc kí được tham khảo từ IP 2010 [44]. Các bước tiến hành như sau:
Pha động: hỗn hợp của acetonitril và dung dịch đệm phosphat pH 3,0 (hòa tan 1,36g KH2PO4 trong 1000ml nước, điều chỉnh tới pH 3,0 bằng acid phosphoric đặc) tỉ lệ 55:45.
Dung dịch chuẩn artesunat: dung dịch chuẩn ART trong dung môi acetonitril có nồng độ chính xác khoảng 1mg/ml.
Dung dịch thử:
- Mẫu thử là artesunat toàn phần trong hệ tiểu phân nano: Lấy chính xác 2,00ml hệ tiểu phân, hòa tan hoàn toàn bằng methanol trong bình định mức 10ml. Lọc dung dịch qua màng 0,45µm.
- Mẫu thử là artesunat tự do trong hệ tiểu phân nano: Lấy chính xác 2,00ml hệ dịch thể có tiểu phân nano ly tâm qua ống siêu ly tâm – lọc với kích thước màng 10000 Dalton tốc độ 5000 vòng/phút trong 30 phút. Dịch trong thu được dưới đáy ống mang lọc qua màng 0,45µm sau đó đem định lượng.
Điều kiện sắc kí:
Cột sắc kí: Zorbax Eclipse C18, 150mm x 4,6mm x 0,5µm. Bước sóng phát hiện: 216 nm
Thể tích mẫu tiêm: 50 µl Tốc độ dòng: 1 ml/phút.
Tiến hành: lần lượt tiêm sắc kí dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Xây dựng đường chuẩn thể hiện mối quan hệ tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ ART. Tính hàm lượng ART trong mẫu thử dựa vào diện tích pic thu được của dung dịch thử và đường chuẩn.
2.4.2.2 Phương pháp đánh giá kích thước tiểu phân
Nguyên tắc xác định KTTP: KTTP được xác định dựa trên phương pháp phổ tán xạ laser (tương quan photo). Chiếu một chùm tia laser vào hệ, ánh sáng tán xạ từ tiểu phân được thu lại và được phân tích. Sự thay đổi của cường độ của chùm laser thu lại cho thấy được tốc độ của chuyển động Brown, từ đó có thể đo được kích thước tiểu phân nhờ phương trình Stokes- Einstein [45].
Kích thước tiểu phân được xác định bằng máy đo kích thước tiểu phân Zetasizer Các mẫu đo đều được pha loãng 10 lần. Phép đo này sử dụng cuvette polystyrene vuông 12 mm DTS0012, chỉ số khúc xạ RI là 1,34 cho dung môi nước với độ hấp thụ 0.001.
2.4.2.3 Phương pháp đánh giá điện thế bề mặt của tiểu phân
Nguyên tắc xác định thế zeta: Khi có một điện trường tác dụng lên hệ tiểu phân, tiểu phân sẽ di chuyển về phía điện cực trái dấu với điện tích bề mặt với vận tốc tỉ lệ với thế zeta. Tốc độ này được xác định dựa trên ánh sáng tán xạ khi tiểu phân chuyển động và liên quan đến thế zeta theo phương trình Smoluchowski [37].
Điện thế bề mặt của tiểu phân được đo bằng máy đo thế Zeta Zetasizer. Các mẫu đo đều được pha loãng 10 lần. Phép đo này sử dụng cuvette mao dẫn có 2 điện cực đồng DTS1060.
2.4.2.4 Phương pháp đánh giá khả năng nạp dược chất của tiểu phân
Hàm lượng artesunat trong mẫu nghiên cứu được tiến hành như sau:
2 ml hỗn dịch sau khi bốc hơi dung môi được ly tâm 5000 vòng/phút trong 30 phút bằng ống siêu ly tâm – lọc. Phần dịch trong thoát ra khỏi ống siêu ly tâm được mang đi định lượng bằng HPLC nhằm xác định lượng dược chất tự do. Lượng dịch còn lại được thêm vào bình định mức 10 ml. Thêm dung môi MeOH đến vạch và hòa tan hoàn toàn để phá vỡ cấu trúc của tiểu phân nano, sau đó dung dịch này cũng được
định lượng bằng phương pháp HPLC với mục đích xác định tổng lượng dược chất tự do và trong tiểu phân.
Hiệu suất nạp thuốc được tính theo công thức sau :
H% = x 100
2.4.2.5 Phương pháp đánh giá khả năng giải phóng dược chất invitro
Nguyên tắc: hệ tiểu phân nano polyme ART được đưa vào môi trường mô phỏng với môi trường huyết tương để đánh giá khả năng giải phóng thuốc theo thời gian.
Mô tả phương pháp:
Môi trường: dung dịch đệm phosphate pH 7,4
2 ml hệ dịch thể được thêm vào ống siêu ly tâm – lọc với kích thước màng 10.000 MWCO, thể tích 4ml. Sau đó đặt hệ dịch thể vào 8ml môi trường và lắc nhẹ trong bể điều nhiệt với nhiệt độ 37oC. Sau một khoảng thời gian cố định, hút 0,5 ml môi trường để định lượng lượng ART và bổ sung một lượng thể tích môi trường mới tương ứng.
Mẫu sau khi thu được mang đi định lượng bằng phương pháp HPLC như đã đề cập ở phần 2.4.2.1. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tổng lượng dược chất – Lượng chất tự do Tổng lượng dược chất
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1.Xây dựng phương pháp định lượng artesunat.
Tiến hành pha một dãy chất chuẩn với các nồng độ ART khác nhau, tiến hành định lượng ART với các điều kiện như trong mục 2.4.2.1. Xây dựng mối quan hệ tuyến tính giữa diện tích pic thu được và nồng độ ART dựa trên phương pháp bình phương tối thiểu. Kết quả thu được thể hiện trong bảng và hình dưới đây:
Bảng 0.1Bảng 3.1 Nồng độ artesunat và diện tích pic tương ứng (n=3)
Nồng độ (µg/ml) Diện tích pic trung bình (mAU.s)
1000 290,65 ± 0,35