3.2.5.1. Chiết xuất và tinh chế
Kết quả định lƣợng mangiferin trong lá xoài tròn cho thấy hàm lƣợng mangiferin ở lá bánh tẻ là cao nhất so với là già và lá non. Để tránh ảnh hƣởng đến
quá trình phát triển cũng nhƣ năng suất cho quả của cây xoài, đồng thời tận dụng nguồn nguyên liệu phế thải từ nông nghiệp, chúng tôi sử dụng lá xoài già để nghiên cứu chiết xuất và phân lập mangiferin.
Chiết xuất: Cân 100g lá xoài già đã sấy khô, nghiền nhỏ (độ ẩm 9,87%) cho vào bình chiết hồi lƣu với 500ml ethanol 70o, trong 2h. Lọc nóng giữ lại bã thu đƣợc dịch chiết lần 1. Thêm tiếp 300ml ethanol 70o
C, chiết hồi lƣu trong 2h, lọc nóng, thu dịch chiết lần 2. Tiếp tục làm nhƣ vậy với lần thứ 3, thu dịch chiết lần 3. Gộp dịch chiết, cô đặc về 500ml, để ở nhiệt độ phòng qua đêm cho mangiferin tủa xuống. Lọc lấy tủa thô, thu đƣợc 2,4979g tủa thô.
Tinh chế: Rửa tủa nhiều lần bằng n-hexan đến khi dịch n-hexan không màu. Cắn thu đƣợc để bay hơi hết n-hexan ở nhiệt độ thƣờng sau đó phân tán vào 50ml ethanol 50o, lắc với 100ml chloroform x 4 lần, gan bỏ lớp chloroform. Pha ethanol- nƣớc đem cô cách thủy ở 80oC đến cắn, thu đƣợc 1,6836g cắn. Hòa tan cắn vào một lƣợng tối thiểu ethanol 70o
, lọc qua giấy lọc, để lạnh qua đêm ở 4-8oC để mangiferin kết tinh lại, lọc lấy tinh thể, rửa bằng cồn lạnh. Kết tinh lại 2 lần sẽ thu đƣợc 0,9327gchất tinh khiết gọi là M.
Hiệu suất của toàn bộ quá trình đạt 15,99%.
3.2.5.2. Kiểm tra độ tinh khiết và sơ bộ nhận dạng M bằng sắc kí lớp mỏng
Chất M đƣợc hòa tan trong methanol tuyệt đối chấm SKLM so sánh với dung dịch mangiferin chuẩn 0,25mg/ml trong methanol.
Điều kiện sắc kí:
Bản mỏng GF 254 đã hoạt hóa ở 100oC trong 1h. Hệ dung môi: (1). Et2O-HCOOH-H2O [2:0,1:0,05] (2). EtOAc-HCOOH-H2O [2:0,3:0,2] (3). BuOH- HCOOH- H2O [2:0,2:0,1] Thuốc thử hiện màu: hơi NH4OH.
Khi quan sát dƣới ánh sáng UV 254, UV 365 và sau khi hiện màu bằng hơi NH4OH đều thấy trên sắc kí đồ của chất M chỉ có 1 vết với vị trí và màu sắc tƣơng
đƣơng với vị trí và màu sắc vết của mangiferin chuẩn. Có thể sơ bộ kết luận chất M tinh khiết.
Bảng 3.6: Giá trị Rf và màu sắc các vết trên sắc kí đồ của chất M và mangiferin chuẩn ở các điều kiện khác nhau
Hệ DM Rf Ánh sáng thƣờng UV 254 UV 365 Hơi NH4OH (1) 0,13 Không nhìn thấy vết (+) Vàng sáng Vàng nâu (2) 0,48 (3) 0,59 (a) (b) (c) (d)
Hình 3.11: Hình ảnh sắc kí đồ chất M so sánh với mangiferin chuẩn, khai triển hệ dung môi Et2 O- HCOOH-H2O [2:0,3:0,2].
Chú thích: (a): Ánh sáng thường, (b): UV 254, (c): UV 365, (d): Hơi NH4OH.
3.2.5.3. Nhận dạng chất M
Cảm quan: Tinh thể hình kim màu vàng nhạt.
Tính chất vật lí: Tan đƣợc trong hỗn hợp cồn- nƣớc, methanol-nƣớc, tan nhẹ
trong methanol, ethanol.
Nhận dạng bằng phổ 1H-NMR và 13C-NMR Bảng 3.7: Phổ 1H, 13C-NMR của M và mangiferin. Vị trí carbon Phổ NMR của M (DMSO-d6) Phổ NMR của mangiferin (MeOD) δc (ppm) δH (ppm) δc (ppm) δH (ppm) 1 161.7 13.74 (1-OH) 161.7 13.80 (1-OH) 2 107.6 -- 107.5 -- 3 163.8 -- 163.8 -- 4 93.3 6.37, s 93.3 6.40, s 4a 156.2 -- 156.2 -- 4b 101.3 -- 101.2 -- 5 102.6 6.86, s 102.4 6.88, s 6 150.8 -- 150.9 -- 7 143.7 -- 143.9 -- 8 108.0 7.38, s 107.8 7.41, s 8a 111.7 -- 111.4 -- 8b 154.0 -- 154.6 -- CO 179.1 -- 179.0 -- 1‟ 73.1 4.59, d, 9.5 Hz 73.1 4.60, d, 8.3 Hz 2‟ 70.2 4.04, t, 8.5 Hz 70.3 4.03, t, 9.5 Hz 3‟ 78.9 3.16, m 79.0 3.16, m 4‟ 70.6 3.16, m 70.6 3.16, m 5‟ 81.5 3.16, m 81.5 3.16, m 6‟ 61.4 3.40, m 3.68, d, 11.5 Hz 61.4 3.40, dd, 11; 2.1 Hz; 3.60, dd, 11; 4.6 Hz
Dựa vào căn cứ dữ liệu phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H, 13C-NMR, so sánh với các dữ liệu phổ đã công bố cho phép kết luận chất thu đƣợc là mangiferin. 3.3. Bàn luận
Về đặc điểm thực vật
Nghiên cứu của chúng tôi đã mô tả đặc điểm hình thái và xác định tên khoa học cho cây xoài tròn Yên Châu, Sơn La là loài Mangifera indica, góp phần làm
phong phú hơn cơ sở dữ liệu về các loài xoài tại Việt Nam. Mặc dù hình dạng quả xoài tròn Yên Châu tròn và ngắn hơn so với mô tả trong tài liệu Cây cỏ Việt Nam tuy nhiên việc xác định tên khoa học chủ yếu đƣợc dựa trên cấu tạo của hoa xoài [8].
Về các kết quả nghiên cứu về đặc điểm vi học: Vi phẫu lá và cuống lá xoài tròn có rất nhiều tế bào cứng và sợi nằm xen kẽ trong lớp mô dày đều, bó libe gần thành hình tròn hoặc bầu dục, rỗng ở giữa, bao quanh libe là một vành tế bào cứng, tinh thể calci oxalat nằm rải rác trong mô mềm và mô dày. Bột lá xoài tròn có rất nhiều tinh thể calci oxalat hình khối kích thƣớc không đều nằm rải rác hoặc thành đám, các tế bào cứng thành dày khoang hẹp. Những đặc điểm đặc trƣng này là cơ sở cho việc xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dƣợc liệu sau này.
Về thành phần hóa học
Các kết quả về định tính hóa học cho thấy trong lá xoài tròn Yên Châu, Sơn La có flavonoid, tanin, steroid-triterpen, carotenoid, đƣờng khử. Không có coumarin, saponin, anthranoid, alkaloid, chất béo, polysarchrid, acid amin, acid hữu cơ. Tuy nhiên, trên thế giới ngƣời ta đã phân lập đƣợc các hợp chất saponin (Indicosid A và B), coumarin (mangcoumarin), chất béo, acid amin từ các bộ phân khác trên cây xoài (M. indica).
Về sắc kí lớp mỏng chúng tôi đã khảo sát và tìm ra hệ dung môi: EtOAc- HCOOH-H2O [10:1,5:1] có khả năng tách tốt các thành phần trong dịch chiết methanol toàn phần của lá xoài. Kết quả định tính bằng sắc kí lớp mỏng cũng một lần nữa khẳng định sự có mặt của mangiferin trong lá xoài tròn (Mangifera indica L.). Điều này hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu trƣớc đây về loài M. indica.
Bên cạnh đó, chúng tôi cũng đã tiến hành khảo sát khả năng chiết xuất mangiferin bằng hỗn hợp dung môi ethanol-nƣớc ở các nồng độ khác nhau, kết quả cho thấy ethanol 70o là dung môi chiết xuất tốt nhất. Đây là một đóng góp mới, tạo cơ sở ban đầu cho việc nghiên cứu xây dựng qui trình chiết xuất trên qui mô công nghiệp.
Sau một thời gian nghiên cứu chúng tôi đã chiết xuất và tinh chế đƣợc mangiferin tinh khiết từ lá xoài tròn. Qui trình chiết xuất sử dụng dung môi ethanol 70o và phƣơng pháp chiết nóng tƣơng tự các nghiên cứu trƣớc đây. Qui trình tinh chế sử dụng phƣơng pháp kết tinh đơn giản. Dung môi chiết xuất và tinh chế chủ yếu là EtOH, thân thiện với môi trƣờng do đó có thể nghiên cứu và ứng dụng vào chiết xuất trên qui mô công nghiệp. Hiệu suất của toàn bộ quá trình chiết xuất và tinh chế đạt 15,99%, thấp hơn so với các nghiên cứu trƣớc đây [9], [33]. Mangiferin là một xanthonnoid có nhiều tác dụng sinh học đang đƣợc quan tâm nhƣ: chống vi rút đặc biệt là vi rút herpet (hiện tại trên thị trƣờng dƣợc phẩm thế giới cúng nhƣ Việt nam đã có rất nhiều sản phẩm phục vụ cho điều trị bệnh do loại vi rút này gây nên), chống đái tháo đƣờng, chống viêm, điều hòa miễn dịch, kháng khuẩn chống oxy hóa… Dữ liệu phổ 1
H-NMR và 13C-NMR thu đƣợc đóng góp vào cơ sở dữ liệu phổ để so sánh nhận dạng mangfierin sau này.
Các kết quả định lƣợng bằng HPLC cho thấy hàm lƣợng mangiferin trong lá xoài tròn Yên Châu-Sơn La khá cao (6-7%), cao hơn so với loài quéo Sơn La (4- 5%) trong một nghiên cứu của Đỗ Hƣơng Lan [10]. Chúng tôi nhận thấy đây là một dƣợc liệu quí có tiềm năng đƣa vào chiết xuất mangiferin trên qui mô công nghiệp. Mặt khác, hàng năm có một số lƣợng lớn lá xoài tròn bỏ đi từ sản xuất nông nghiệp. Nếu nguồn nguyên liệu lá xoài này đƣợc tận dụng để chiết xuất mangiferin sẽ làm tăng thêm giá trị và hình thành chuỗi giá trị liên hoàn cho cây xoài. Phƣơng pháp HPLC là một phƣơng pháp có thời gian phân tích ngắn, độ đúng độ, chính xác và độ nhạy cao hơn nhiều so với phƣơng pháp đo phổ hấp thụ UV-VIS. Các chất đƣợc phân tách ra trong quá trình định lƣợng nên tránh đƣợc ảnh hƣởng của chất màu cũng nhƣ các tạp chất khác trong dịch chiết đƣợc liệu. Cùng với sự phát triển của
khoa học kĩ thuật, phƣơng pháp này ngày càng đƣợc ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực kiểm nghiệm nói chung và kiểm nghiệm dƣợc liệu nói riêng. Việc sử dụng phƣơng pháp này trong kiểm nghiệm dƣợc liệu sẽ giúp đánh giá tốt hơn chất lƣợng của dƣợc liệu trƣớc khi đƣa vào sử dụng.
Chƣơng 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
4.1. Kết luận
Sau thời gian làm thực nghiệm chúng tôi đã thu đƣợc những kết quả sau:
Về thực vật
Đã mô tả đặc điểm hình thái và giám định tên khoa học cho cây xoài tròn thu hái tại huyện Yên Châu, Sơn La là loài Mangifera indica L., họ Anacardiaceae.
Mô tả chi tiết đặc điểm vi phẫu gân lá, cuống lá và đặc điểm bột lá của cây xoài tròn Yên Châu, Sơn La góp phần làm cơ sở cho việc kiểm nghiệm và tiêu chuẩn hóa dƣợc liệu sau này.
Về hóa học
Bằng phản ứng hóa học đã xác định đƣợc trong lá xoài tròn Yên Châu có các thành phần: flavonoid, tanin, carotenoid, steroid-triterpen, đƣờng khử.
Kết quả định tính bằng sắc kí lớp mỏng có so sánh với mangiferin chuẩn, khai triển hệ dung môi EtOAc-HCOOH-H2O [10:1,5:1] cho thấy trong lá xoài tròn Yên Châu, Sơn La có mangiferin.
Đã khảo sát khả năng chiết xuất mangiferin của hỗn hợp dung môi EtOH- H2O bằng SKLM và HPLC, nhận thấy EtOH 70o là dung môi có khả năng chiết mangiferin tốt nhất.
Bằng phƣơng pháp HPLC, đã khảo sát hàm lƣợng mangiferin trong lá xoài tròn Yên Châu, Sơn La: lá bánh tẻ có hàm lƣợng mangiferin cao nhất (7,39%), tiếp đến là lá xoài non (6,78%) và lá xoài già (6,47%).
Đã tiến hành chiết xuất, tinh chế và xác định đƣợc cấu trúc của mangiferin từ lá xoài tròn Yên Châu, Sơn La.
4.2. Đề xuất
Do thời gian nghiên cứu có hạn nên đề tài của chúng tôi chỉ nghiên cứu đƣợc những bƣớc đầu về loài xoài tròn Yên Châu, Sơn La. Đề nghị tiếp tục nghiên cứu tìm ra qui trình chiết xuất và tinh chế mangiferin có hiệu suất cao trên qui mô công nghiệp
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Trần Thị Phƣơng Anh, Nguyễn Tiến Bân. Lê Kim Biên (2003), Danh lục các loài thực vật Việt Nam, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội.
2. Bộ môn Dƣợc liệu Trƣờng đai học Dƣợc Hà Nội (2008), Dược liệu học, tập I và II, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
3. Bộ môn Dƣợc liệu Trƣờng đai học Dƣợc Hà Nội (2010), Thực tập dược liệu,
Trung tâm thông tin-thƣ viện Trƣờng Đại Học Đƣợc Hà Nội, Hà Nội.
4. Bộ môn Thực Vật Trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội (2007), Thực vật học, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
5. Bộ môn Thực Vật, Trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội (2012), Thực tập thực vật và nhận biết cây thuốc, Trung tâm thông tin-thƣ viện Trƣờng Đại Học Đƣợc Hà
Nội, Hà Nội.
6. Võ Văn Chi (2007), Sách tra cứu tên cây cỏ Việt Nam, NXB Giáo Dục, Hà Nội. 7. Bùi Thị Hằng (1991), “Định lƣợng mangiferin bằng phƣơng pháp sắc kí lỏng cao
áp”, Tạp chí dược học (số 5), 28-38.
8. Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam, Quyển II, NXB Trẻ, Tp Hồ Chí Minh. 9. Phạm Gia Khôi và Phạm Xuân Sinh (1991), “Nghiên cứu chiết xuất và xác định
Flavonoid mangiferin trong lá xoài”, Tạp chí Dược học (số 5), 8,19.
10. Đỗ Hƣơng Lan (2002), Nghiên cứu sự tích lũy và biến động hàm lƣợng Mangiferin trong quá trình sinh trƣởng và phát triển của cây quéo Sơn La và tiếp tục phân lập thành phần hóa học trong lá của nó, Khóa luận tôt nghiệp Dược sĩ, Trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội, Hà Nội.
11. Đỗ Tất Lợi (2011), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Thời đại, Hà
Nội.
12. Lê Thị Thúy (2001), Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học trong cây Quéo Sơn La, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội, Hà Nội.
13. Viện Dƣợc Liệu (2003), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Tập II,
NXB Khoa học kĩ thuật, Hà Nội.
Tài liệu tiếng Anh
14. Andrade E H A.; Maia J G S, Zoghbi M G B (2000), “Aroma volatile constituents of Brazilian varieties of mango fruit”, Journal of Food Composition
and analysis, 13, 27-33.
15. Ana M. Dzbreveamić, Petar D. Marin, Adebayo A. Gbolade và Mihailo S. Ristić (2010), “Chemical Composition of Mangifera indica Essential Oil From
Nigeria”, Journal of Essential Oil Research , 22,123-125.
16. Andreas S., Nicolai B., Reinhold C. (2003), “Identification of flavonol and xanthon glycoside from Mango (Mangifera indica L Cv. “ Tommy Atkins”) peels by High-Performance Liquid Chromatography-Electrospray Ionization Mass Spectrometry”, Journal of Agriculture and Food chemistry, 51, 5006-5011. 17. Anjaneyulu V, Ravi K, Harischandra PK, Conolly J D (1985), “Triterpenoids
from Mangifera Indica”, Phytochembtry, 24, No. 10, 2359-2361, 1985.
18. Anjaneyulu V, Ravi K, Harischandra PK, Conolly J D (1989), “Triterpenoids from Mangifera Indica”,Phytochembtry, 28, No. 10, 1471-1477.
19. Anjaneyulu V, Suresh Babu J, Murali Krishna M (1992), “Triterpenoid and steroid from Mangifera indica”, Acta cienia Indica Chemistry, 18, 173-176. 20.Anjaneyulu V, Suresh Babu J, Murali Krishna M, Conolly J D (1993), “3-Oxo-
20(S),24(R), Epoxy-dammarane-25β,26-diol from Mangifera indica”, Phytochemistry, 32, 469-471.
21. Anjaneyulu V, Suresh Babu J, Ravi K, Connolly J D (1994), “29- Hydroxymangiferonic acid from Mangifera Indica”, Phytochemistry, 35, 1301-
1303.
22. Anjaneyulu V, Satyanarayana P, Viswanadham KN, Joythi VG, Rao KN, Radhika P (1999), “Triterpenoids from Mangifera Indica”, Phytochemistry, 50,
23. Ansari SH, Ali MOhd, Naquvi K.J. (2012), “ A new oxotirucalloic acid from the sterm bark of Mangifera indica Var. “ Langra””, International research journal of pharmacy, 156-158.
24. Bandyopadhyay C, Gholap A.C., Mamdapur VR (1985), “Characterization of alkenylresorcinol in Mango (M. indica) Latex”, Journal of Agriculture and food Chemistry, vol 33, 377-379.
25. Berardini, N.; Schieber, A.; Klaiber, I.; Beifuss, U.; Carle, R.; Conrad, J. (2005), “7-O-Methylcyanidin 3-O-β-D-Galactopyranoside, a novel Anthocyanin from Mango (Mangifera indica L. cv. „Tommy Atkins‟) Peels”, Journal contribution,
801-804.
26. Cojocaru M, Droby S, Glotter E, Goldman A, Gottlieb H E (1986), “ 5-(12- Heptadecenyl)-resorcinol, the major component of the antifungal activity in the peel of Mango fruit”, Phytochemistry, vol 25, 1093-1095.
27. Escobedo‐Martínez C; Concepción L. M ; Hernández‐Ortega S, Villarreal M.L., Gnecco D., Enríquez R. G, William R.. (2012), “1H and 13C NMR characterization of new cycloartane triterpenes from Mangifera indica”, Magnetic Resonance in Chmistry, 50(1), 52-57.
28. Flora of China Editorial Committee (2009), Flora of china vol 11, Missouri
Botanical Garden Press and Science Press, China, 235-257.
29. Gaydou EM, Bouchet P (1984), “Sterols, methyl sterol, triterpene alcohols and fatty acids of the kernel fat of different Malagasy Mango (Mangifera indica) varieties”, Journal off American oil chemists’ Society, 61, 1589-1593.
30. Golsal A S, Biswas K and Chattopadhyway BK (1978), “Differences in the Chemical constituents of Mangifera indica infected with Aspergilus niger and
Fusarium miniliformal”, Phytochemistry, 17, 689-694.
31. Gupta J, Ali M (1999), “Phytochemical investigation of Mangifera indica root
bank”, Indian Journal of chemistry, 38B, 1903-1908.
32. Jieping Qin&, Jiagang Deng, Xu Feng, Qin Wang, Shengbo Wang (2008), “Quantitative RP–LC Analysis of Mangiferin and Homomangiferin in Mangifera
indica L. Leaves and in Mangifera persiciforma C.Y. Wu et T.L. Ming Leaves”, Chromatographia, 68 (11-12), 955-960.
33. A Jutiviboonsuk, C Sardsaengjun (2010), “Mangiferin in Leaves of Three Thai Mango (Mangifera indica L.) Varieties”, Indian journal pathology and microbiology, 6(3). 122-129.
34. Khan MA, Nizami SS, Khan MNI, Azzeem Sw (1992), “Biflavone from
Mangifera indica”, Pakistan Journal off pharmaceutical science, 5, 155-159. 35. Khan MA, Nizami SS, Khan MNI, Almed Z (1993), “ New Saponins from
Mangifera indica”, Journal of Natural product, 56, 767-770.
36. Kolhe JN, Bhaskar A, Brongi NV (1982), “Occurrence of 3-Oxo triterpenes in the unsaponifiable matter of some vegetable”, Lipids, 17, 166-168.
37. Kostermans A.J.G.H. and Bompard J.M. (1993), The Mangoes, Their Botany, Nomenclature, Horticulture and Utilization, Academic Press, London.
38. MacLeod A. J.; Pieris N. M (1984) “Comparison of the volatile components of