2.4.1. Nghiên cứu thực vật
- Nghiên cứu đặc điểm hình thái: Mô tả phân tích đặc điểm hình thái theo phƣơng pháp mô tả phân tích cây thuốc [4], [5]. Làm tiêu bản khô và lƣu mẫu tiêu bản tại Phòng tiêu bản thực vật, bộ môn thực vật trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội. Dựa trên cơ sở các kết quả phân tích đặc điểm thực vật kết hợp với các tài liệu để xác định tên khoa học của cây xoài tròn Yên Châu, Sơn La.
- Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu lá xoài tròn: Tiêu bản vi phẫu lá và cuống lá đƣợc làm theo phƣơng pháp cắt tẩy và nhuộm kép. Tiêu bản đƣợc chụp trên kính hiển vi. Các đặc điểm giải phẫu lá và cuống lá đƣợc phân tích theo nguyên tắc nghiên cứu tiêu bản vi phẫu [5].
- Nghiên cứu đặc điểm bột lá xoài tròn: Dƣợc liệu sau khi làm sạch, cắt nhỏ, sấy khô đƣợc đem tán nhỏ, làm tiêu bản soi bột [4]. Các đặc điểm đƣợc mô tả theo phƣơng pháp môt tả bột dƣợc liệu [3].
2.4.2. Nghiên cứu về hóa học
- Định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học: Các phản ứng hóa học đƣợc tiến hành theo nguyên tắc chiết xuất và định tính các hợp chất hữu cơ có trong dƣợc liệu bằng phản ứng hóa học [2], [3].
- Định tính bằng sắc kí lớp mỏng
Bản mỏng GF254 đã hoạt hóa ở 110oC trong 1h. Dịch chấm sắc kí đƣợc chiết bằng dung môi MeOH.
Hệ dung môi khảo sát: (1). CHCl3- EtOAc-HCOOH [4 : 8 : 1,5]. (2). EtOAc-HCOOH-H2O [10 : 1,5 : 1].
Phƣơng pháp phát hiện: Quan sát dƣới ánh sáng thƣờng, UV 254, UV 365, hiện màu bằng hơi ammoniac dƣới ánh sáng thƣờng [48].
- Chiết xuất và tinh chế mangiferin từ lá xoài
Chiết xuất: Sử dụng phƣơng pháp chiết hồi lƣu với dung môi EtOH 70o. Tinh chế: Loại tạp nhiều lần bằng n-hexan và chloroform, sau đó sử dụng phƣơng pháp kết tinh trong EtOH.
- Nhận dạng chất phân lập: đƣợc dựa trên tính chất hóa lý và phổ 1H- NMR và phổ 13C-NMR.
- Khảo sát hàm lượng mangiferin trong lá xoài bằng phương pháp HPLC
Tiến hành: Cân chính xác khoảng 1,00g bột lá xoài đã xác định độ ẩm cho
vào bình chiết hồi lƣu 2h với 20ml ethanol 90o, lọc nóng thu dịch chiết lần 1. Thêm tiếp 20ml EtOH 90o, tiếp tục chiết hồi lƣu trong 2h, lọc nóng, thu dịch chiết lần 2. Tiến hành tƣơng tự chiết lần thứ 3. Gộp dịch chiết 3 lần vào bình định mức 100ml bổ sung bằng dung môi chiết xuất cho đủ thể tích (dung dịch 1). Sau đó lấy 1ml dịch chiết cho vào bình định mức dung tích 50ml bổ sung bằng dung mối chiết xuất cho đủ thể tích (dung dịch 2). Lấy 1ml dung dịch 2 cho vào bình định mức dung tích 10ml, thêm pha động đến vạch (dung dịch 3). Dung dịch 3 đƣợc phân tích bằng HPLC.
Điều kiện sắc kí: Cột BDS Hypersil C18 (250x4,6mm; 5µm); Pha động:
Acetonitril - Dung dịch CH3COOH 3% (14:86); Lƣu lƣợng dòng 1,0ml/phút; Bộ phân phát hiện: Detector UV- VIS. Bƣớc sóng: 257nm. Thể tích tiêm mẫu 20µl.
Phương pháp xử lí số liệu: Số liệu thu đƣợc đƣợc xử lý bằng phần mềm
Microsoft Ofice Excel 2007:
Dựng đƣờng chuẩn mangiferin. Tính hàm lƣợng mangiferin:
Nồng độ mangiferin (C) trong dịch chiết đƣợc tính theo đƣờng chuẩn mangifeirn
Lƣợng Mangiferin /1ml dung dịch 1: mmangiferin= C . h2.h3 = 500.C
Với: h2: độ pha loãng từ dung dịch 1 thành dung dịch 2
h3: độ pha loãng từ dung dịch 2 thành dung dịch 3. Hàm lƣợng Mangiferin đƣợc tính theo công thức:
6 .100.10 .100 .(1 ) Mangiferin Dl m m HA M Dl: khối lƣợng dƣợc liệu (g). HA: hàm ẩm của dƣợc liệu
Chƣơng 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM
3.1. Kết quả nghiên cứu về thực vật
3.1.1. Đặc điểm hình thái của cây xoài tròn huyện Yên Châu, tỉnh Sơn La
Cây thân gỗ, cao, sống lâu năm.
Lá đơn, nguyên, mọc so le, có cuống. Cuống lá dài 2,5-3,5cm có thể dài tới 5-6cm. Phiến lá nguyên hình mũi mác, dài 24-27cm có thể dài tới 35cm, rộng 5,5- 6,5cm. Gốc lá thuôn nhọn. Ngọn lá nhọn hoắt, phần cuối kéo dài bóp nhọn tạo thành đuôi dài khoảng 1-1,5cm. Gân lá hình lông chim, có khoảng 21-23 đôi gân phụ. Mặt trên lá màu xanh đậm, bóng. Mặt dƣới màu xanh nhạt. Mạng lƣới gân dày, nhìn thấy rõ ở cả hai mặt. Cành non mập.
Hình 3.1: Hình ảnh cây và hoa xoài tròn Yên Châu, Sơn La.
Cụm hoa dạng chùm kép 3-4 lần, hình chùy hoặc hình tháp, dài đến 30-35 cm, phủ lông mịn, trục chính có màu hồng tím hoặc hồng phớt. Lá bắc con hình tam giác, phủ lông mịn, dài khoảng 1,5-2mm, màu xanh, rụng sớm. Trên chùm hoa có 2 loại hoa: hoa lƣỡng tính và hoa đực. Hoa nhỏ, đều, rất thơm. Cuống hoa có khớp, dài khoảng 2-3mm, phủ lông mịn. Hoa mẫu 5 (có khi là 4 hoặc 6), 5 (có khi 4 hoặc
6) lá đài rời dài khoảng 2 mm màu xanh nhạt, phủ lông mịn; 5 (4 hoặc 6) cánh hoa rời, thƣờng nhẵn, dài khoảng 3,5-4mm. Trên cánh có 5 sống nổi rõ màu vàng hoặc hoặc hồng tím, phần gốc dính liền, phần đỉnh sống không tách khỏi bề mặt cánh. Cánh hoa mới nở có màu vàng nhạt sau chuyển sang màu hồng tím, cong ngƣợc về phía sau. Tiền khai hoa dạng van. Đĩa mật giống cái đệm, do 4-5 bộ phận hợp thành, cao 1-1,5mm, nằm ngoài bao lấy nhị và bầu nhụy. Bộ nhị chỉ có 1 nhị hữu thụ có kích thƣớc lớn hơn, chỉ nhị hữu thụ dài khoảng 2mm; có thể có 1 nhị bất thụ, nhị bất thụ nếu có dài khoảng 0,5- 0,7mm, thiếu bao phấn hoặc bao phấn lép. Bao phấn đính lƣng, 4 ô. Hoa lƣỡng tính có bộ nhụy do 1 lá noãn hợp thành bầu thƣợng, màu xanh nhạt, đƣờng kính 1-1,5mm, bầu 1 ô với 1 noãn, đính noãn bên. Vòi nhụy đính lệch sang bên phía đối diện với nhị hữu thụ, dài 1,5-2mm. Hoa đực có bầu nhụy tiêu biến hoàn toàn hoặc rất nhỏ, vòi nhụy vẫn còn hoặc tiêu biến.
Công thức hoa *♀ K5 C5 A1 hoặc 2 G(1) và*♂ K5C5A1 hoặc 2.
Quả có hạch, hình xoài, có mũi lệch, tù. Vỏ giữa có xơ, vỏ qủa trong dày cứng chắc.
Hình 3.2: Ảnh chụp các bộ phận của hoa, quả, lá xoài tròn
Chú thích: (1a), (1b): Hoa cái nguyên vẹn có hoặc không có nhị bất thụ, (1c): Hoa đực, (2a)-(2b): Hoa cắt dọc, (3a)-(3b): Lá bắc cấp 1-cấp 2, (4): Đài hoa, (5a)-(5b:) Cánh hoa, (6:) Đĩa mật, (7a): Nhị bất thụ, (7b): Nhị hữu thụ, (7c): Bao phấn, (8a): Bầu nhụy,(8b): Bầu cắt dọc, (8c): Bầu cắt ngang, (9): Các bộ phân của hoa khi xếp trên một mặt phẳng, (10): Lá, (11): Quả xoài, (12a)-(12b): Lát cắt dọc và cắt ngang quả xoài, (13): Hạt, (14): Nội nhũ.. (1a) (1b) (1c) (2a) (3a) (2b) (3a) (4) (7a) (7b) (5a)
(5a) (8a) (8a)
(8c) (6) (7c) (9) (10) (11) (12b) (13) (14) (12a )
Dựa trên bản mô tả đặc điểm hình thái cây xoài tròn đƣợc thu hái ở huyện Yên Châu, tỉnh Sơn La; căn cứ vào các tài liệu phân loại và khóa phân loại hiện có nhƣ Danh lục các loài thực vật Việt Nam, Thực vật chí Trung Quốc, Thực vật chí
Đông Dương, Thực vật chí Campuchia-Lào-Việt Nam, dƣới sự hƣớng dẫn của TS.
Nguyễn Quốc Huy, chúng tôi đã giám định mẫu xoài tròn Yên Châu, Sơn La (HNIP/1782/13) là loài: Mangifera indica L, họ Anacardiaceae.
3.1.2. Đặc điểm vi phẫu lá và cuống lá xoài tròn
Vi phẫu gân chính và phiến lá
Gân chính:
Gân chính có lát cắt ngang lồi cả hai mặt. Lớp biểu bì gồm một hàng các tế bào hình chữ nhật xếp đều đặn. Phủ ngoài lớp biểu bì là một lớp cutin mỏng. Dƣới lớp biểu bì là lớp mô dày tròn với các tế bào hình bầu dục hoặc hình tròn. Tinh thể calci oxalat nằm rải rác trong các tế bào mô dày và mô mềm. Xen kẽ trong lớp mô dày là các tế bào cứng và sợi, lá càng già thì số lƣợng càng nhiều có khi tạo thành một lớp gần nhƣ liên tục ngay dƣới lớp biểu bì. Ở mặt dƣới, các tế bào cứng và sợi nằm ngay sát lớp biểu bì tạo thành một vòng liên tục ngay sát lớp biểu bì. Lớp tế bào mô mềm với tế bào hình tròn hoặc hình bầu dục, thành mỏng. Các bó libe- gỗ cấu tạo cấp 2 có kích thƣớc không đều xếp thành vòng tròn. Đỉnh các bó libe- gỗ có các đám tế bào mô cứng ôm lấy bó libe, tạo thành một vành ở bên ngoài lớp libe. Phần libe thƣờng có hình gần tròn hoặc bầu dục, rỗng ở giữa. Dƣới lớp gỗ cấp 2 là mô mềm ruột với các tế bào hình tròn có kích thƣớc không đều thành mỏng.
Phiến lá:
Bên ngoài là lớp biểu bì gồm một hàng tế bào hình chữ nhật xếp đều đặn, biểu bì mặt trên dày hơn mặt dƣới. Bên dƣới lớp biểu bì là các tế bào mô giậu hình chữ nhật dài xếp vuông góc với lớp biểu bì. Tiếp đó là lớp mô mềm hình bầu dục hoặc hình đa giác thành mỏng. Tinh thể calci oxalat nằm rải rác trong các tế bào mô mềm.
Hình 3.3 : Vi phẫu gân chính và phiến lá xoài tròn.
Hình 3.4: Một góc của vi phẫu Hình 3.5: Vi phẫu phiến lá xoài tròn. gân lá xoài tròn
Chú thích: (1): Lớp Cutin, (2): Biểu bì, (3): Mô dày, (4): Tế bào mô cứng và sợi., (5): Mô mềm, (6): Mô cứng bao ngoài libe, (7): Libe cấp 2, (8): Gỗ cấp 2, (9:) Mô mềm ruột, (10): Mô dậu, (11): Tinh thể calci oxalat.
Vi phẫu cuống lá
Lát cắt cuống lá có hình gần giống hình tròn. Ngoài cùng là lớp cutin mỏng bao ngoài, tiếp đến là lớp biểu bì gồm một hàng tế bào hình chữ nhật xếp đều đặn. Lớp tế bào mô dày hình tròn, hình bầu dục, vách tế bào dày đều (mô dày tròn). Xen
4 1 1 1 1 1 1 6 7 1 1 1 1 1 1 10 3 5 8 9 10 1 11 2 4
giữa lớp mô dày là các tế bào cứng và sợi xếp thành vòng gần nhƣ liên tục, lá càng già thì các tế bào sợi càng nhiều, vòng càng liên tục. Dƣới lớp mô dày là 1-2 hàng tế bào mô mềm hình tròn hoặc bầu dục thành mỏng. Có nhiều tinh thể calci oxalat nằm rải rác trong các tế bào. Các bó libe-gỗ kích thƣớc khác nhau, xếp thành vòng tròn. Đỉnh các bó libe-gỗ cũng có vòng tế bào cứng ôm lấy bó libe nhƣ ở gân chính của lá. Libe cấp 2 hình tròn hoặc bầu dục rỗng ở giữa. Trong cùng là mô mềm ruột.
Hình 3.6: Vi phẫu cuống lá Xoài tròn.
Hình 3.7: Một góc của vi phẫu cuống lá xoài tròn.
Chú thích: (1): Cutin, (2): Biểu bì, (3): Mô dày, (4): Mô cứng và sợi, (5): Mô mềm, (6): Libe, (7): Gỗ, (8): Mô mềm ruột, (9): Tế bào cứng ôm lấy bó libe-gỗ, (10): Tinh thể calci oxalat. 2 4 5 6 3 9 7 8 10 1 2
3.1.3. Đặc điểm bột lá xoài tròn
Bột màu xanh lục, mùi thơm nhẹ, vị chát. Soi dƣới kính hiển vi nhìn thấy: Mảnh mô mềm gồm các tế bào hình bầu dục, hình tròn, thành mỏng (1); mảnh mô mềm có mang theo tinh thể calci oxalat (2). Mảnh mạch chủ yếu là mạch điểm (3), mạch vạch (4). Các mảnh mang màu nâu đỏ nằm rải rác (5). Sợi gồm các tế bào dài, thành dày khoang hẹp thƣờng tập trung thành từng bó (6). Các tế bào cứng thành dày, khoang hẹp (7). Rất nhiều tinh thể calci oxalat hình khối kích thƣớc khác nhau nằm rải rác (8), hoặc thành từng đám (9). Mảnh biểu bì (10) và mảnh biểu bì có mang lỗ khí (11), lỗ khí (12).
Hình 3.8: Các đặc điểm của bột lá xoài tròn.
Chú thích: (1): Mảnh mô mềm, (2): Mảnh mô mềm mang tinh thể calci oxalat, (3): Mạch điểm, (4): Mạch vạch, (5): Mảnh mang màu, (6): Bó sợi, (7): Tế bào cứng, (8): Tinh thể calci oxalat hình khối, (9): Đám tinh thể calci oxalat, (10): Mảnh biểu bì, (11): Mảnh biểu bì có mang lỗ khí, (12): Lỗ khí. 0,1mm 0,1mm (1) (2) (10) (11) (3) (4) (6) (5) (7) (9) (8) (12)
3.2. Kết quả nghiên cứu về hóa học
3.2.1. Định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học 3.2.1.1. Flavonoid 3.2.1.1. Flavonoid
Cân 0,5g dƣợc liệu cho vào ống nghiệm lớn, thêm 15ml cồn 90o đun trực tiếp 10 phút. Lọc nóng qua bông, dịch lọc thu đƣợc dùng để làm các phản ứng.
- Phản ứng với NH4OH
Nhỏ một 2 giọt dịch chiết cồn lên 2 tờ giấy lọc, sấy khô, đem một tờ giấy lọc hơ trên miệng lọ NH4OH đặc thấy màu vàng của vết dịch chiết đậm và sáng hơn hẳn so với vết dịch chiết trên tờ giấy lọc còn lại. (Phản ứng dƣơng tính).
- Phản ứng với NaOH 10%:
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết, thêm 3 giọt NaOH 10%, thấy xuất hiện nhiều tủa vàng. (Phản ứng dƣơng tính).
- Phản ứng Cyanidyn
Cho vào ống nghiệm khoảng 1ml dịch chiết, thêm một ít bột Mg kim loại, sau đó nhỏ vài giọt HCl đặc, thấy xuất hiện màu đỏ. (Phản ứng dƣơng tính).
- Phản ứng với FeCl3
Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, nhỏ 2 giọt FeCl3 5% thấy xuất hiện màu xanh đen. (Phản ứng dƣơng tính).
Sơ bộ kết luận trong lá xoài tròn có flavonoid.
3.2.1.2. Coumarin
Cân 10g dƣợc liệu cho vào bình nón 100ml, thêm 50ml cồn 90, đun trực tiếp 10 phút, lọc nóng qua giấy lọc. Dịch lọc thu đƣợc dùng để làm phản ứng.
- Phản ứng mở đóng vòng lacton
Cho vào hai ống nghiệm mỗi ống 1ml dịch chiết. Thêm vào ống 1 0,5ml dung dịch NaOH 10%. Ống 2 để nguyên. Sau khi thêm kiềm, ống 1 xuất hiện tủa vàng.
Đun cả hai ống nghiệm đến sôi. Để nguội. Ống 1 có tủa vàng. Ống 2 trong Thêm vào cả hai ống mỗi ống 2ml nƣớc cất, lắc đều. Ống 1 có tủa đục. Ống 2 trong suốt.
Acid hóa ống 1 bằng 5-6 giọt HCl đặc, ống 1 vẫn có tủa đục, ống 2 trong suốt. (Phản ứng âm tính).
Phản ứng Diazo hóa:
Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 2ml dung dịch NaOH 10%. Nhỏ 5 giọt thuốc thử Diazo mới pha, lắc đều, đun nóng cách thủy, thấy xuất hiện màu đỏ. (Phản ứng dƣơng tính).
Phản ứng huỳnh quang:
Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên giấy lọc, sấy khô, nhỏ một giọt NaOH 10% chồng lên trên, sấy khô. Che một phần vết bằng một đồng xu kim loại, đặt dƣới ánh sáng UV 366nm. Phần không bị che phát quang màu vàng xanh. Sau 1 phút, bỏ đồng xu kim loại ra thấy phần bị che và phần bị che phát quang giống nhau. (Phản ứng âm tính).
Vi thăng hoa:
Cho một ít dƣợc liệu vào nắp nhôm. Đặt lên bếp hồng ngoại, cho bay hơi hết hơi nƣớc trong dƣợc liệu. Đặt lên nắp nhôm một phiến kính, trên phiến kính để một ít bông tẩm nƣớc lạnh, sau 5phút lấy phiến kính ra để nguội, nhỏ thêm một giọt thuốc thử KI 10% lên phiến kính. Soi dƣới kính hiển vi không thấy có tinh thể. (Phản ứng âm tính).
Sơ bộ kết luận trong lá xoài tròn không có coumarin.
3.2.1.3. Saponin
Hiện tượng tạo bọt: Cân 10g dƣợc liệu cho vào bình nón dung tích 100ml,
thêm 30ml nƣớc, đun sôi trực tiếp 10 phút, lọc nóng qua bông. Cho 5ml dịch lọc vào một ống nghiệm lớn, thêm 5ml nƣớc lắc mạnh trong 5phút, cột bọt tồn tại trong khoảng 6 phút. (Phản ứng âm tính).
Sơ bộ kết luận trong lá xoài tròn không có saponin.
3.2.1.4. Alcaloid
Cân 10g bột lá xoài cho vào bình nón 100ml, thêm 30ml H2SO4 1N, đun sôi 20 phút. Để nguội, lọc dịch chiết vào bình gạn dung tích 100ml, kiềm hóa bằng NH4OH6N đến pH kiềm, thử bằng giấy quì. Chiết bằng 5ml CHCl3 x 3 lần, gạn lấy
lớp CHCl3. Sau đó chiết tiếp với dung dịch 5ml H2SO4 x 2 lần. Dich chiết thu đƣợc chia đều vào 3 ống nghiệm nhỏ. Nhỏ vào từng ống nghiệm lần lƣợt 3 giọt các thuốc thử sau:
Ống 1: TT Mayer. Qan sát không thấy tủa trắng. (Phản ứng âm tính). Ống 2: TT Bouchardart. Quan sát không thấy tủa nâu. (Phản ứng âm tính). Ống 3: TT Dragendoff. Quan sát không thấy tủa vàng. (Phản ứng âm tính).
Sơ bộ kết luận lá xoài tròn không có alcaloid.
3.2.1.5. Anthranoid
Cân 5g dƣợc liệu cho vào bình nón thêm 25ml H2SO4 1N, đun sôi trực tiếp 5 phút, lọc nóng qua bông vào bình gạn 50ml. Để nguội, thêm 5ml ethyl ether, lắc nhẹ, gạn bỏ lớp nƣớc, giữ lại lớp ether, cô về 1ml, thêm 1ml dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ. Lớp nƣớc không thấy xuất hiện màu đỏ sim. (Phản ứng âm tính).
Sơ bộ kết luận trong lá xoài tròn không có athranoid.
3.2.1.6. Tannin
Cho vào ống nghiệm lớn 1g bột lá xoài, thêm 10ml nƣớc cất, đun sôi trực tiếp trong 10phút. Lọc nóng qua bông. Dịch lọc thu đƣợc đem làm các phản ứng: - Phản ứng với genlatin 1%
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch lọc, thêm 3 giọt gelatin 1%. Thấy xuất hiện tủa bông trắng. (Phản ứng dƣơng tính).
- Phản ứng với chì acetat 10%
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch lọc, thêm 3 giọt chì acetat thấy xuất hiện kết tủa bông vàng tƣơi. (Phản ứng dƣơng tính).
- Phản ứng với FeCl3
Cho vào ống nghiệm 1ml dịch lọc, thêm 3 giọt FeCl3 thấy xuất hiện tủa đen. (Phản ứng dƣơng tính).
Sơ bộ kết luận lá xoài tròn có tannin.
3.2.1.7. Chất béo, carotenoid, sterol
Cân 10g bột lá xoài cho vào bình nón có nút mài dung tích 100ml, thêm 40ml ether dầu hỏa, đậy kín, ngâm trong 24h, lọc qua giấy lọc, dịch chiết thu đƣợc