thuốc nghiên cứu
2.4.2.1. Phương pháp xác định độc tính cấp
Xác định độc tính cấp theo hướng dẫn kèm theo quyết định số 371/BTY-QĐ của Bộ y tế ngày 12/03/1996 về xác định độ an toàn cho thuốc cổ truyền, có tham khảo hướng dẫn của OECD và 1 số tác giả khác [1], [7], [43].
Thí nghiệm được tiến hành trên chuột nhắt trắng giống cái khỏe mạnh khối lượng cơ thể 18 - 22g.
Để chuột nhịn đói 2 giờ trước khi dùng thuốc. Chuột được chia thành nhiều lô. Cho từng lô uống chế phẩm thử với liều tăng dần. Thể tích chế phẩm thử cho uống tương ứng với 0,2ml/10g chuột. Sau khi uống chế phẩm thử, chuột được theo dõi trong vòng 72 giờ và tính tỷ lệ chuột chết của mỗi lô thí nghiệm trong khoảng thời gian trên.
Nếu có chuột chết, mổ để quan sát những thay đổi cơ quan nội tạng bằng mắt thường.
LD50 (nếu có) được tính bằng phương pháp Litch field – Wilcoxon.
Xác định độc tính bán trường diễn của bài thuốc nghiên cứu theo hướng dẫn của OECD [42].
Động vật thí nghiệm
Chuột nhắt trắng trọng lượng 18 2g nuôi ở điều kiện phòng thí nghiệm (nhiệt độ 25 C, 12 giờ sáng/12giờ tối) trong vòng 5 ngày.
Tiến hành
Chia ngẫu nhiên chuột nhắt trắng mỗi giống (đực hoặc cái) thành 3 lô, mỗi lô 10 động vật.
Lô 1: Lô chứng uống nước.
Lô 2: Lô uống cao lỏng bài thuốc nghiên cứu với liều 8,64g/kg chuột nhắt (liều gấp đôi liều thể hiện tác dụng dược lí).
Lô 3: Lô uống cao lỏng bài thuốc nghiên cứu với liều 25,92g/kg chuột nhắt (liều gấp 6 lần liều thể hiện tác dụng dược lí).
Chuột được uống nước hoặc thuốc hàng ngày vào buổi sáng với liều 0,1ml/10g trước khi ăn, liên tục trong vòng 28 ngày. Kiểm tra cân nặng của chuột hàng tuần. Kết thúc thí nghiệm lấy máu mắt của chuột cho vào 2 loại ống nghiệm: ống chống đông để làm các xét nghiệm huyết học và ống không chứa chất chống đông, ly tâm lấy huyết thanh để làm các xét nghiệm hóa sinh. Mổ toàn bộ động vật thí nghiệm để quan sát đại thể các cơ quan, lấy ngẫu nhiên 3 chuột đực và 3 chuột cái trong mỗi lô để làm tiêu bản vi thể gan và thận.
Thông số đánh giá
− Tình trạng toàn thân: hàng ngày theo dõi các biểu hiện của động vật thực nghiệm (tình trạng da, lông, mắt, sự tiết dịch mũi, miệng, hô hấp, phân, nước tiểu…). Hàng tuần cân động vật thực nghiệm để theo dõi sự thay đổi khối lượng cơ thể, đồng thời để điều chỉnh lượng thuốc cho chuột uống.
− Các thông số huyết học: số lượng hồng cầu, nồng độ hemoglobin, tỷ lệ hematocrit, thể tích trung bình hồng cầu, lượng huyết sắc tố trung bình hồng cầu, nồng độ huyết sắc tố trung bình hồng cầu, số lượng tiểu cầu, số lượng bạch cầu.
− Các thông số hóa sinh: hoạt độ transaminnase huyết thanh (AST, ALT), glucose, cholesterol toàn phần, protein toàn phần, creatinin huyết thanh, bilirubin toàn phần.
− Đại thể cơ quan: quan sát cảm quan các cơ quan tim, gan, thận. Cân ngay khối lượng các cơ quan và tính tỉ lệ so với khối lượng toàn bộ cơ thể.
− Mô bệnh học: sau khi giết động vật thí nghiệm, các mẫu gan và thận được bảo quản trong dung dịch formol 10%, cắt các lát mỏng, nhuộm hematoxylin – eosin và quan sát dưới kính hiển vi phân cực để đánh giá cấu trúc hình thái vi thể gan, thận. Tiêu bản được thực hiện tại Bộ môn Giải phẫu bệnh, Trường Đại Học Y Hà Nội. Kết quả được đánh giá bởi PGS.TS. Trần Văn Hợp.