Mô hình tạo sỏi tiết niệu in vivo được tiến hành theo mô tả bởi Jie Fan, Michael A.Glass and Paramjit S.Chandhoke [37] có thay đổi cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm. Gây sỏi cho chuột bằng ethylen glycol và amoni clorid với các nồng độ khác nhau. Dựa vào kết quả nghiên cứu chúng tôi đã tiến hành đánh giá tác dụng của bài thuốc nghiên cứu trên chuột đã gây sỏi tiết niệu bằng ethylen glycol 1% và amoni clorid 0,5%.
Nguyên tắc của mô hình nghiên cứu là tạo sỏi calci oxalate in vivo, theo dõi sự hình thành sỏi và khả năng ức chế hình thành sỏi của bài thuốc nghiên cứu thông qua việc quan sát tinh thể calci oxalate niệu được tạo thành dưới kính hiển vi và quan sát sự lắng đọng của tinh thể calci oxalat trong thận.
Tính toán mức liều sử dụng trong nghiên cứu
Mức liều sử dụng trong nghiên cứu được quy đổi dựa trên liều dược liệu thường dùng theo kinh nghiệm, ngoại suy cho động vật thí nghiệm.
Nghiên cứu sử dụng 3 mức liều của bài thuốc với các bước nhảy liều theo cấp số nhân cụ thể như sau:
− DC1: Dịch chiết dược liệu với liều 2,52 g/kg cho chuột cống trắng tương đương với liều 18g bài thuốc/50kg người (tính theo dược liệu khô).
− DC2: Dịch chiết dược liệu với liều 5,04 g/kg cho chuột cống trắng gấp 2 lần DC1 tương đương với liều 36g bài thuốc/50kg người (tính theo dược liệu khô).
− DC3: Dịch chiết dược liệu với liều 10,08 g/kg cho chuột cống trắng gấp 2 lần DC2 tương đương với liều 72g bài thuốc/50kg người (tính theo dược liệu khô).
Thiết kế nghiên cứu
Chuột cống trắng được chia ngẫu nhiên 5 lô, mỗi lô 6 con trong đó:
Lô 1: Lô chứng trắng, uống nước. Lô 2: Lô chứng bệnh, uống nước.
Lô 3: Lô uống DC1 (với liều 2,52g/kg chuột cống tính theo dược liệu khô). Lô 4: Lô uống DC2 (với liều 5,04g/kg chuột cống tính theo dược liệu khô). Lô 5: Lô uống DC3 (với liều 10,08 g/kg chuột cống tính theo dược liệu khô). Tất cả chuột cống trắng được nuôi thích nghi với điều kiện thí nghiệm (nhiệt độ 25 C, 12 giờ sáng/12 giờ tối) trong vòng 5 ngày. Sau đó tiến hành gây sỏi tiết niệu trong 28 ngày. Tất cả các lô ngoại trừ lô 1 được thay uống nước hàng ngày bằng dung dịch có chứa ethylen glycol 1% và amoni clorid 0,5%. Hàng ngày, chuột ở các lô được uống nước hoặc uống chế phẩm thử tương ứng với cùng thể tích vào buổi sáng, lúc đói (1ml/100g). Chuột uống chế phẩm thử liên tục trong vòng 28 ngày. Thu gom nước tiểu 5 giờ vào các ngày trước khi gây sỏi và ngày 28 của đợt thí nghiệm. Kết thúc thí nghiệm gây mê chuột bằng ether, cắt lấy 2 thận để làm giải phẫu thận.
Quy trình thí nghiệm được mô tả ở hình 2.1.
Thông số đánh giá
− Cách thu và phân tích nước tiểu:
Nước tiểu được thu vào các ngày trước khi gây sỏi và ngày 28. Mỗi động vật được cho vào một lồng hứng nước tiểu riêng, nước tiểu của từng chuột được gom sau mỗi 30 phút – 1 giờ. Gộp nước tiểu thu được sau 5 giờ của từng động vật. Trong quá trình thu nước tiểu không cho chuột ăn, cho uống nước bằng kim đầu tù
5 ngày 28 ngày
Thích nghi điều kiện thí nghiệm
Gây sỏi và uống chế phẩm thử hàng ngày
0 Bắt đầu
28
Hứng nước tiểu 5 giờ Thu thận
Hình 2.1: Quy trình thí nghiệm gây sỏi tiết
1ml/100g chuột/giờ. Sau khi thu nước tiểu tiến hành xác định thể tích, pH nước tiểu. Tiến hành li tâm nước tiểu với tốc độ 3000 rpm (revolutions per minute) trong 10 phút, phần cặn tiến hành soi trên kính hiển vi ở vật kính x40 để xác định số lượng, loại tinh thể, kích thước tinh thể và chụp lại hình ảnh trên vi trường bằng máy ảnh có kết nối với kính hiển vi.
− Thu thận:
Vào ngày cuối cùng của đợt thí nghiệm, sau khi tiến hành thu nước tiểu 5 giờ, tất cả động vật thí nghiệm được gây mê bằng ether, cắt lấy 2 thận. Xác định khối lượng của 2 thận.Thận phải của chuột được bảo quản trong formol 10% để làm giải phẫu mô bệnh học.
− Thông số đánh giá:
+ Khối lượng chuột thí nghiệm. + Thể tích nước tiểu trong 5 giờ. + pH nước tiểu chuột thí nghiệm.
+ Định lượng ion , , .
+ Mật độ tinh thể, hình dạng tinh thể calci oxalat trong nước tiểu.
Cho điểm dựa vào số lượng tinh thể, hình dạng tinh thể (dựa theo cách cho điểm của F.Atmani [27]) cụ thể như sau:
Bảng 2.1: Thang điểm đánh giá
Số lượng tinh thể COD
Điểm Số lượng tinh thể
COM Điểm
Không tinh thể
0 Không tinh thể 0
4 - 5 tinh thể 2 4 - 5 tinh thể 2
6 tinh thể 3
6 tinh thể 3
+ Đại thể cơ quan thận: Quan sát thận ngay sau khi lấy khỏi cơ thể chuột. Cân ngay khối lượng thận và tính tỷ lệ so với khối lượng toàn bộ cơ thể.
+ Mô bệnh học: Tiêu bản mô bệnh học thận được soi dưới kính hiển vi quang học phân cực để xác định các tinh thể lắng đọng trong thận. Tiêu bản được thực hiện tại Bộ môn Giải phẫu bệnh, Trường Đại học Y Hà Nội. Kết quả được đánh giá bởi PGS.TS.Trần Văn Hợp.