− Thành phần bài thuốc nghiên cứu gồm 3 dược liệu: + Lá cây Bồ đề (Ficus religinosa L.Moraceae) + Thân cây Ý dĩ (Coix lachrymal-jobi L.Poaceae)
+ Bộ phận trên mặt đất của cây Xấu hổ (Mimosa pudica L.Mimosaceae)
Các dược liệu được thu hái ở ngoại thành Hà Nội vào tháng 10 năm 2012 và được xác định tên khoa học bởi tiến sĩ Trần Thế Bách (Viện Sinh Thái Tài Nguyên Sinh Vật – Viện Khoa Học Việt Nam). Dược liệu được rửa sạch, cắt nhỏ, phơi sấy khô, cắt, tán nhỏ.
− Chuẩn bị dịch chiết dược liệu:
Dịch chiết cồn của từng vị dược liệu được chuẩn bị bằng phương pháp ngâm lạnh. Ngâm lạnh 48 giờ đầu thu được dịch chiết lần 1. Lần thứ 2 và thứ 3 cũng ngâm lạnh với cồn 70º và tiến hành rút dịch chiết sau 24 giờ. Gộp dịch chiết, lọc qua giấy lọc 0,45 µm, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, tiếp tục tiến hành cô dịch chiết được cao lỏng 5:1. Gộp các dịch chiết của từng vị dược liệu với tỷ lệ bằng nhau thu được chế phẩm cuối cùng để thử tác dụng sinh học và độc tính. 2.2. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
2.2.1. Động vật thí nghiệm
− Chuột cống trắng, cả 2 giống, cân nặng khoảng 150 , do Học viện quân y cung cấp.
− Chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả 2 giống, cân nặng khoảng 20 2 g do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp.
Động vật được nuôi ổn định với điều kiện phòng thí nghiệm ít nhất 5 ngày trước khi thực hiện nghiên cứu, được nuôi dưỡng bằng thức ăn tiêu chuẩn do Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp, uống nước tự do.
2.2.2. Hóa chất thuốc thử
− Ethylen glycol ( ), 1,111 – 1,115g/ml,
Xilong chemical.
− Amoni clorid ( ), 99,5% - 100,5%, Xilong chemical.
− Các dung môi, hóa chất và thuốc thử khác: formol, ethanol, natri hydroxid, bộ kít định lượng protein, cholesterol, creatinin, bilirubin…đạt tiêu chuẩn phân tích.
2.2.3. Thiết bị và dụng cụ
− Máy cất nước 2 lần Hamillton của hãng Hamillton Laboratory Glas Limited, − Kính hiển vi kết nối máy ảnh của hãng Laica.
− Máy điều chỉnh pH, model Euteck instrument pH 510. − Máy li tâm HERMLE Z300.
− Máy cất quay Buchi Rotavapor R210.
− Tủ sấy chân không Heraeus-instrument vacutherm-Kelvitront. − Cân kĩ thuật Precisa-BJ610C, TE 412 (Sartorius).
− Dụng cụ hứng nước tiểu.
− Các dụng cụ khác như : micropipett, ống nghiệm, đầu côn các loại… 2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
− Đánh giá tác dụng của bài thuốc trên mô hình gây sỏi tiết niệu bằng ethylen glycol và amoni clorid.
− Xác định độc tính cấp và bán trường diễn của bài thuốc nghiên cứu. 2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.1. Phương pháp đánh giá tác dụng của bài thuốc trên sỏi tiết niệu in vivo
Mô hình tạo sỏi tiết niệu in vivo được tiến hành theo mô tả bởi Jie Fan, Michael A.Glass and Paramjit S.Chandhoke [37] có thay đổi cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm. Gây sỏi cho chuột bằng ethylen glycol và amoni clorid với các nồng độ khác nhau. Dựa vào kết quả nghiên cứu chúng tôi đã tiến hành đánh giá tác dụng của bài thuốc nghiên cứu trên chuột đã gây sỏi tiết niệu bằng ethylen glycol 1% và amoni clorid 0,5%.
Nguyên tắc của mô hình nghiên cứu là tạo sỏi calci oxalate in vivo, theo dõi sự hình thành sỏi và khả năng ức chế hình thành sỏi của bài thuốc nghiên cứu thông qua việc quan sát tinh thể calci oxalate niệu được tạo thành dưới kính hiển vi và quan sát sự lắng đọng của tinh thể calci oxalat trong thận.
Tính toán mức liều sử dụng trong nghiên cứu
Mức liều sử dụng trong nghiên cứu được quy đổi dựa trên liều dược liệu thường dùng theo kinh nghiệm, ngoại suy cho động vật thí nghiệm.
Nghiên cứu sử dụng 3 mức liều của bài thuốc với các bước nhảy liều theo cấp số nhân cụ thể như sau:
− DC1: Dịch chiết dược liệu với liều 2,52 g/kg cho chuột cống trắng tương đương với liều 18g bài thuốc/50kg người (tính theo dược liệu khô).
− DC2: Dịch chiết dược liệu với liều 5,04 g/kg cho chuột cống trắng gấp 2 lần DC1 tương đương với liều 36g bài thuốc/50kg người (tính theo dược liệu khô).
− DC3: Dịch chiết dược liệu với liều 10,08 g/kg cho chuột cống trắng gấp 2 lần DC2 tương đương với liều 72g bài thuốc/50kg người (tính theo dược liệu khô).
Thiết kế nghiên cứu
Chuột cống trắng được chia ngẫu nhiên 5 lô, mỗi lô 6 con trong đó:
Lô 1: Lô chứng trắng, uống nước. Lô 2: Lô chứng bệnh, uống nước.
Lô 3: Lô uống DC1 (với liều 2,52g/kg chuột cống tính theo dược liệu khô). Lô 4: Lô uống DC2 (với liều 5,04g/kg chuột cống tính theo dược liệu khô). Lô 5: Lô uống DC3 (với liều 10,08 g/kg chuột cống tính theo dược liệu khô). Tất cả chuột cống trắng được nuôi thích nghi với điều kiện thí nghiệm (nhiệt độ 25 C, 12 giờ sáng/12 giờ tối) trong vòng 5 ngày. Sau đó tiến hành gây sỏi tiết niệu trong 28 ngày. Tất cả các lô ngoại trừ lô 1 được thay uống nước hàng ngày bằng dung dịch có chứa ethylen glycol 1% và amoni clorid 0,5%. Hàng ngày, chuột ở các lô được uống nước hoặc uống chế phẩm thử tương ứng với cùng thể tích vào buổi sáng, lúc đói (1ml/100g). Chuột uống chế phẩm thử liên tục trong vòng 28 ngày. Thu gom nước tiểu 5 giờ vào các ngày trước khi gây sỏi và ngày 28 của đợt thí nghiệm. Kết thúc thí nghiệm gây mê chuột bằng ether, cắt lấy 2 thận để làm giải phẫu thận.
Quy trình thí nghiệm được mô tả ở hình 2.1.
Thông số đánh giá
− Cách thu và phân tích nước tiểu:
Nước tiểu được thu vào các ngày trước khi gây sỏi và ngày 28. Mỗi động vật được cho vào một lồng hứng nước tiểu riêng, nước tiểu của từng chuột được gom sau mỗi 30 phút – 1 giờ. Gộp nước tiểu thu được sau 5 giờ của từng động vật. Trong quá trình thu nước tiểu không cho chuột ăn, cho uống nước bằng kim đầu tù
5 ngày 28 ngày
Thích nghi điều kiện thí nghiệm
Gây sỏi và uống chế phẩm thử hàng ngày
0 Bắt đầu
28
Hứng nước tiểu 5 giờ Thu thận
Hình 2.1: Quy trình thí nghiệm gây sỏi tiết
1ml/100g chuột/giờ. Sau khi thu nước tiểu tiến hành xác định thể tích, pH nước tiểu. Tiến hành li tâm nước tiểu với tốc độ 3000 rpm (revolutions per minute) trong 10 phút, phần cặn tiến hành soi trên kính hiển vi ở vật kính x40 để xác định số lượng, loại tinh thể, kích thước tinh thể và chụp lại hình ảnh trên vi trường bằng máy ảnh có kết nối với kính hiển vi.
− Thu thận:
Vào ngày cuối cùng của đợt thí nghiệm, sau khi tiến hành thu nước tiểu 5 giờ, tất cả động vật thí nghiệm được gây mê bằng ether, cắt lấy 2 thận. Xác định khối lượng của 2 thận.Thận phải của chuột được bảo quản trong formol 10% để làm giải phẫu mô bệnh học.
− Thông số đánh giá:
+ Khối lượng chuột thí nghiệm. + Thể tích nước tiểu trong 5 giờ. + pH nước tiểu chuột thí nghiệm.
+ Định lượng ion , , .
+ Mật độ tinh thể, hình dạng tinh thể calci oxalat trong nước tiểu.
Cho điểm dựa vào số lượng tinh thể, hình dạng tinh thể (dựa theo cách cho điểm của F.Atmani [27]) cụ thể như sau:
Bảng 2.1: Thang điểm đánh giá
Số lượng tinh thể COD
Điểm Số lượng tinh thể
COM Điểm
Không tinh thể
0 Không tinh thể 0
4 - 5 tinh thể 2 4 - 5 tinh thể 2
6 tinh thể 3
6 tinh thể 3
+ Đại thể cơ quan thận: Quan sát thận ngay sau khi lấy khỏi cơ thể chuột. Cân ngay khối lượng thận và tính tỷ lệ so với khối lượng toàn bộ cơ thể.
+ Mô bệnh học: Tiêu bản mô bệnh học thận được soi dưới kính hiển vi quang học phân cực để xác định các tinh thể lắng đọng trong thận. Tiêu bản được thực hiện tại Bộ môn Giải phẫu bệnh, Trường Đại học Y Hà Nội. Kết quả được đánh giá bởi PGS.TS.Trần Văn Hợp.
2.4.2.Phương pháp xác định độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của bài
thuốc nghiên cứu
2.4.2.1. Phương pháp xác định độc tính cấp
Xác định độc tính cấp theo hướng dẫn kèm theo quyết định số 371/BTY-QĐ của Bộ y tế ngày 12/03/1996 về xác định độ an toàn cho thuốc cổ truyền, có tham khảo hướng dẫn của OECD và 1 số tác giả khác [1], [7], [43].
Thí nghiệm được tiến hành trên chuột nhắt trắng giống cái khỏe mạnh khối lượng cơ thể 18 - 22g.
Để chuột nhịn đói 2 giờ trước khi dùng thuốc. Chuột được chia thành nhiều lô. Cho từng lô uống chế phẩm thử với liều tăng dần. Thể tích chế phẩm thử cho uống tương ứng với 0,2ml/10g chuột. Sau khi uống chế phẩm thử, chuột được theo dõi trong vòng 72 giờ và tính tỷ lệ chuột chết của mỗi lô thí nghiệm trong khoảng thời gian trên.
Nếu có chuột chết, mổ để quan sát những thay đổi cơ quan nội tạng bằng mắt thường.
LD50 (nếu có) được tính bằng phương pháp Litch field – Wilcoxon.
Xác định độc tính bán trường diễn của bài thuốc nghiên cứu theo hướng dẫn của OECD [42].
Động vật thí nghiệm
Chuột nhắt trắng trọng lượng 18 2g nuôi ở điều kiện phòng thí nghiệm (nhiệt độ 25 C, 12 giờ sáng/12giờ tối) trong vòng 5 ngày.
Tiến hành
Chia ngẫu nhiên chuột nhắt trắng mỗi giống (đực hoặc cái) thành 3 lô, mỗi lô 10 động vật.
Lô 1: Lô chứng uống nước.
Lô 2: Lô uống cao lỏng bài thuốc nghiên cứu với liều 8,64g/kg chuột nhắt (liều gấp đôi liều thể hiện tác dụng dược lí).
Lô 3: Lô uống cao lỏng bài thuốc nghiên cứu với liều 25,92g/kg chuột nhắt (liều gấp 6 lần liều thể hiện tác dụng dược lí).
Chuột được uống nước hoặc thuốc hàng ngày vào buổi sáng với liều 0,1ml/10g trước khi ăn, liên tục trong vòng 28 ngày. Kiểm tra cân nặng của chuột hàng tuần. Kết thúc thí nghiệm lấy máu mắt của chuột cho vào 2 loại ống nghiệm: ống chống đông để làm các xét nghiệm huyết học và ống không chứa chất chống đông, ly tâm lấy huyết thanh để làm các xét nghiệm hóa sinh. Mổ toàn bộ động vật thí nghiệm để quan sát đại thể các cơ quan, lấy ngẫu nhiên 3 chuột đực và 3 chuột cái trong mỗi lô để làm tiêu bản vi thể gan và thận.
Thông số đánh giá
− Tình trạng toàn thân: hàng ngày theo dõi các biểu hiện của động vật thực nghiệm (tình trạng da, lông, mắt, sự tiết dịch mũi, miệng, hô hấp, phân, nước tiểu…). Hàng tuần cân động vật thực nghiệm để theo dõi sự thay đổi khối lượng cơ thể, đồng thời để điều chỉnh lượng thuốc cho chuột uống.
− Các thông số huyết học: số lượng hồng cầu, nồng độ hemoglobin, tỷ lệ hematocrit, thể tích trung bình hồng cầu, lượng huyết sắc tố trung bình hồng cầu, nồng độ huyết sắc tố trung bình hồng cầu, số lượng tiểu cầu, số lượng bạch cầu.
− Các thông số hóa sinh: hoạt độ transaminnase huyết thanh (AST, ALT), glucose, cholesterol toàn phần, protein toàn phần, creatinin huyết thanh, bilirubin toàn phần.
− Đại thể cơ quan: quan sát cảm quan các cơ quan tim, gan, thận. Cân ngay khối lượng các cơ quan và tính tỉ lệ so với khối lượng toàn bộ cơ thể.
− Mô bệnh học: sau khi giết động vật thí nghiệm, các mẫu gan và thận được bảo quản trong dung dịch formol 10%, cắt các lát mỏng, nhuộm hematoxylin – eosin và quan sát dưới kính hiển vi phân cực để đánh giá cấu trúc hình thái vi thể gan, thận. Tiêu bản được thực hiện tại Bộ môn Giải phẫu bệnh, Trường Đại Học Y Hà Nội. Kết quả được đánh giá bởi PGS.TS. Trần Văn Hợp.
2.4.3. Phương pháp xử lí số liệu
Kết quả được biểu diễn dưới dạng M SE (M: giá trị trung bình từng lô, SE: sai số chuẩn). So sánh giá trị trung bình giữa các lô bằng one-way ANOVA, dùng hậu kiểm Dunnett test để so sánh giá trị trung bình của các lô thử với lô chứng bệnh (với thiết kế nhiều lô) hoặc TTest để so sánh giá trị trung bình của lô chứng bệnh với lô chứng trắng.
Với các số liệu không thuộc phân phối chuẩn, kết quả được trình bày dưới dạng trung vị và khoảng (giá trị cực tiểu – giá trị cực đại). Dùng thuật toán Kruskal Wallis để so sánh giữa các lô, Mann – Whitney U test để so sánh kết quả giữa lô thử với lô chứng.
Phân tích thống kê bằng phần mềm SPSS 16.0, sự khác biệt giữa các lô được coi là có ý nghĩa khi p<0,05.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. KẾT QUẢ THỬ TÁC DỤNG CỦA BÀI THUỐC NGHIÊN CỨU TRÊN MÔ HÌNH GÂY SỎI TIẾT NIỆU IN VIVO HÌNH GÂY SỎI TIẾT NIỆU IN VIVO
3.1.1. Ảnh hưởng của bài thuốc nghiên cứu đến sự tăng trưởng khối lượng cơ
thể chuột trên mô hình gây sỏi tiết niệu in vivo
Theo dõi khối lượng cơ thể của chuột ở các lô trong suốt quá trình thực nghiệm.Ghi lại khối lượng cơ thể của chuột hàng tuần. Kết quả được thể hiện trong hình 3.1:
Hình 3.1: Ảnh hưởng của bài thuốc nghiên cứu đến sự tăng trưởng khối lượng cơ thể của chuột
Nhận xét:
Khối lượng cơ thể chuột ở lô chứng bệnh có xu hướng giảm ở tuần 1, từ tuần thứ 2 đến hết thời gian thực nghiệm khối lượng cơ thể chuột lô này có xu hướng tăng.
Chuột ở lô chứng trắng, các lô uống chế phẩm thử tăng khối lượng trong suốt quá trình thực nghiệm.
Khối lượng cơ thể chuột ở các lô không có sự khác biệt trong quá trình thực nghiệm.
3.1.2. Ảnh hưởng của bài thuốc nghiên cứu đến thể tích và pH nước tiểu của
chuột cống trắng trên mô hình gây sỏi tiết niệu in vivo
Sau khi thu nước tiểu 5 giờ của từng chuột vào ngày 28, tiến hành xác định thể tích nước tiểu, đo pH nước tiểu.
3.1.2.1. Ảnh hưởng của bài thuốc nghiên cứu đến thể tích nước tiểu
K h ố i lư ợ n g c ơ t h ể (g )
Xác định thể tích nước tiểu 5 giờ của từng lô. So sánh thể tích nước tiểu 5 giờ của các lô uống chế phẩm thử với lô chứng bệnh, lô chứng bệnh và lô chứng trắng để thấy ảnh hưởng của bài thuốc nghiên cứu đến thể tích nước tiểu chuột thí nghiệm.
Bảng 3.1: Ảnh hưởng của bài thuốc nghiên cứu đến thể tích nước tiểu
Lô Liều
(g/kg)
Thể tích (ml)
Tỷ lệ tăng so với lô chứng bệnh (%) Chứng trắng (n=6) − 5,0 Chứng bệnh (n=6) − 2,7 Lô uống DC1 (n=6) 2,52 4,5 65,6 Lô uống DC2 (n=6) 5,04 4,4 60,4 Lô uống DC3 (n=6) 10,08 4,5 64,8
a, p<0,05 khi so sánh với lô chứng trắng b, p<0,05 khi so sánh với lô chứng bệnh Nhận xét:
Kết quả cho thấy, thể tích nước tiểu 5 giờ của lô chứng bệnh thấp hơn lô chứng trắng, khác biệt có ý nghĩa thống kê với p<0,05.
Thể tích nước tiểu 5 giờ thu được ở các lô uống chế phẩm thử nhiều hơn khi so sánh với lô chứng bệnh, tỷ lệ tăng so với lô chứng bệnh trên 60% (với p<0,05).
3.1.2.2. Ảnh hưởng của bài thuốc nghiên cứu đến pH nước tiểu
Sau khi xác định thể tích nước tiểu 5 giờ của chuột, tiến hành đo pH nước tiểu chuột của từng lô. Kết quả được thể hiện ở hình 3.2.
Hình 3.2: Ảnh hưởng của bài thuốc nghiên cứu đến pH nước tiểu chuột
a, p<0,05 khi so sánh với lô chứng trắng Nhận xét:
pH nước tiểu thu được ở lô chứng bệnh thấp hơn khi so sánh với lô chứng trắng, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p<0,05. Như vậy, việc gây sỏi bằng ethylen glycol và amoni clorid làm giảm pH nước tiểu chuột.
pH nước tiểu của các lô uống chế phẩm thử không có sự khác biệt khi so sánh với lô chứng bệnh.
3.1.3. Ảnh hưởng của bài thuốc nghiên cứu đến các ion , , trên mô
hình gây sỏi tiết niệu in vivo
Định lượng các chỉ số , , trong nước tiểu 5 giờ vào ngày 28. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2: Ảnh hưởng của bài thuốc nghiên cứu đến các ion , ,
Lô Liều (g/kg) Natri (mmol/L) Kali (mmol/L) Clo (mmol/L) Lô chứng trắng Lô uống DC1 Lô uống DC2 Lô chứng bệnh Lô uống DC3 a
Chứng trắng (n=6) − 32,0 10,1 197,3 35,4 54,6 10,7 Chứng bệnh (n=6) − 23,7 4,6 215,5 3,0 62,3 17,6 Lô uống DC1 (n=6) 2,52 30,4 9,0 182,3 18,1 89,4 14,3 Lô uống DC2 (n=6) 5,04 23,0 11,8 165,1 30,1 54,6 11,7 Lô uống DC3 (n=6) 10,08 49,8 17,2 291,0 40,7 93,0 11,7