Geriacheva (theo mô tả của Nguyễn Văn Mùi) [10]
Nguyên tắc: amylase có khả năng thủy phân tinh bột tạo thành các dextrin có khối lượng mol khác nhau. Khi cho tác dụng với Iốt chúng sẽ tạo màu. Đo cường độ màu tạo thành tính được hoạt độ enzym amylase. Đơn vị hoạt độ enzym amylase là lượng enzym xúc tác thủy phân được 1g tinh bột thành dextrin có phân tử lượng khác nhau ở nhiệt độ 300C trong 1 giờ.
Hóa chất: Dung dịch HCl 1N: lấy 8,2ml HCl đặc cho vào bình định mức 100ml, dâng nước cất đến vạch. Dung dịch Iốt gốc: hòa tan 0,5g Iốt và 5g KI trong một lượng nhỏ nước, lắc nhẹ, chuyển vào bình định mức 200ml, dâng nước đến vạch, bảo quản trong lọ màu, dùng trong 1 tháng. Dung dịch Iốt phân tích: pha loãng 2ml dung dịch Iốt gốc bằng dung dịch HCl 0,1N trong bình định mức 100ml. Dung dịch đệm axetat (pH 4,8): chuẩn bị dung dịch axit axetic 0,2M (dung dịch a): bằng cách lấy 11,55ml axit axetic đặc dẫn nước đến mức 1000ml, chuẩn bị dung dịch natri axetat 0,2M (dung dịch b): cân 16,4g CH3COONa hòa tan vào 100ml nước cất. Lấy 20ml dung dịch a và 30ml dung dịch b cho vào bình định mức 100ml, dâng nước lên mức 100ml. Dung dịch tinh bột 1%: hòa tan 1g tinh bột trong bình
định mức 100ml với 50ml nước cất, lắc đều đến khi tinh bột hòa tan hoàn toàn, làm nguội bình và bổ sung 10ml đêm axetat (pH 4,8), thêm nước cất đến mức 100ml, lắc đều. Dung dịch dùng trong ngày. Dịch chiết enzym: cân 200mg mẫu nghiền nhỏ trong 6ml dung dịch đệm axetat, li tâm lạnh 12000 vòng/15 phút thu dịch chứa enzim - amylase.
Dụng cụ, thiết bị: Cối chày sứ, bình định mức, pipet, cốc thủy tinh…, máy li tâm lạnh, tủ ấm, máy quang phổ tử ngoại khả kiến UV-Vis 2450 Shimadzu (Nhật Bản).
Cách tiến hành:
Cho vào 2 bình nón loại 50ml, mỗi bình 10ml dung dịch tinh bột 1% và đặt vào máy ủ nhiệt ở 300C, giữ trong 10 phút.
Thêm vào bình 2 (bình thí nghiệm) 5ml dịch chiết enzym. Khuấy đều và giữ 10 phút.
Lấy từ mỗi bình 0,5ml hỗn hợp cho vào 2 bình khác nhau cho chứa 50ml dung dịch Iốt. Lắc đều. Bình đối chứng có màu xanh, bình thí nghiệm có màu tím.
Đo OD656nm. Mật độ quang bình đối chứng (OD1) là lượng tinh bột ban đầu. Mật độ quang bình thí nghiệm (OD2) là lượng tinh bột còn lại sau khi α-amylase thủy phân. Sự khác nhau giữa mật độ quang bình đối chứng và bình thí nghiệm là lượng tinh bột bị enzym thủy phân.
Cách tính hoạt độ:
Lượng tinh bột bị thủy phân (c):
c = OD −OD OD . 0,1
0,1: là lượng tinh bột phân tích
Hoạt độ enzym α-amylase: HdAm UI
g =
6,889. c−0,029388
Trong đó: