Qua qu trình chọn lọc và cải t o giống ằng đ t iến UV, HTKS của chủng
Streptomyces 166.28 tăng lên rõ rệt so với an đầu.
Bằng phƣơng ph p SLNN, ta thu đƣ c m t số d ng chủng có HTKS cao, đặc iệt là d ng chủng 6. Kết quả này có đƣ c là do trong quần th , có sự iến dị tự nhiên theo c c tần số kh c nhau, trong đó có c c c th có ho t tính kh ng sinh m nh gấp 1,1-1,2 lần những c th kh c.
Sau khi đ t iến UV lần 1, với đ sống sót 0,29%, ta thu đƣ c đa phần là c c iến chủng có % iến đổi ho t tính dƣơng, ên c nh đó c ng có m t số iến chủng có % iến đổi ho t tính âm. Trong c c iến chủng có % iến đổi ho t tính dƣơng, l i có sự iến đổi kh c nhau về t c dụng của c c iến chủng. Cụ th là, có iến chủng tăng HTKS đồng đều cả trên S. flexneri và B. cereus (cao nhất là iến chủng 6.12: tăng 112,20% trên S. flexneri và tăng 110,06% trên B. cereus so với mẫu chứng); có iến chủng chỉ tăng HTKS trên S. flexneri mà không tăng trên B. cereus
(đi n hình nhất là iến chủng 6.11 : tăng 116,90% trên S. flexneri và giảm ho t tính trên B. cereus so với mẫu chứng); có iến chủng chỉ tăng HTKS trên B. cereus mà không tăng trên S. flexneri ( iến chủng đ i diện là 6.26: tăng 110,85% trên B. cere- us và giảm HTKS trên S. flexneri). Điều này đƣ c giải thích là do nh s ng UV t c đ ng vào chu i ADN gây ra sự iến đổi ho t tính kh c nhau giữa c c iến chủng.
Đối với đ t iến lần 2, ta hƣớng về t c dụng chọn lọc trên S. flexneri, nên đã tiến hành đ t iến tiếp iến chủng 6.11 với đ sống sót tính to n đƣ c là 0,17%. Tuy nhiên, trong c c iến chủng có % iến đổi ho t tính dƣơng thì đa số đều tăng ho t tính cả trên S. flexneri và B. cereus. Trong đó chỉ có iến chủng 11.11 tăng ho t tính nhiều nhất trên S. flexneri và ít nhất trên B. cereus với % iến đổi ho t tính lần lƣ t là 112,16% và 101,95%. Tuy nhiên, đ thu đƣ c iến chủng có t c dụng chọn lọc tốt hơn trên S. flexneri, cần th nghiệm c c phƣơng ph p đ t iến kh c:
52
đ t iến hóa học (HNO2; nitroguanin; dimethylsulfat), tia Rơnghen,… Do thời gian nghiên cứu h n h p nên đề tài chƣa có điều kiện tiến hành c c phƣơng ph p này. 4.2. Nâng cao hiệu suất chiết t ch kh ng sinh
Bằng việc cải tiến qu trình chiết t ch, ta đã nâng cao đƣ c hiệu suất chiết tách kháng sinh, thu đƣ c c c thành phần kh ng sinh tinh khiết.
Khi thực hiện chiết xuất, kh ng sinh đƣ c chuy n từ pha nƣớc sang pha dung môi hữu cơ nên đã lo i đƣ c c c t p chất tan trong nƣớc. Có hai dung môi chiết kh ng sinh từ dịch lọc tốt nhất là n – butanol và ethylacetat đều ở pH 3. Tuy nhiên, s dụng ethylacetat ƣu việt hơn vì thời gian cất quay ngắn hơn nhiều, tiết kiệm chi phí cất quay hơn so với n – butanol. Điều này đƣ c giải thích là do nhiệt đ sôi của ethylacetat (khoảng 70,40C) thấp hơn nhiều so với nhiệt đ sôi của n – butanol (khoảng 1170C - 1180C). Nên ta chọn ethyacetat là dung môi chiết xuất kh ng sinh. Tuy vậy, chiết kh ng sinh ằng ethylacetat, pha nƣớc vẫn còn HTKS, chứng tỏ kh ng sinh chƣa đƣ c chiết kiệt khỏi pha nƣớc. Đ nâng cao hiệu suất chiết, có hai iện ph p đã đƣ c th nghiệm. Biện ph p thứ nhất là s dụng phƣơng ph p chiết nhiều lần, ta thấy: sau 3 lần chiết thì kh ng sinh đã đƣ c chiết kiệt sang pha ethylacetat. C ch này dễ tiến hành song gây tốn thời gian và dung môi chiết. Do đó, c ch thứ hai đã đƣ c đề xuất là thêm muối NaCl vào dịch lọc trƣớc khi chiết, với lƣ ng thêm 20g/500ml. Ta nhận thấy sau 1 lần chiết thì kh ng sinh đã đƣ c chiết kiệt sang pha ethylacetat. Cơ chế có th đƣ c giải thích là do muối làm tăng sự chuy n pha của kháng sinh.
Sau khi chiết xuất, kh ng sinh đƣ c tinh chế đ tiếp tục lo i t p. Với lần tinh chế thứ nhất, ằng việc s dụng hệ Butylacetat: Acetone: Triethylamin = 1: 2: 1, ta đã lo i đƣ c t p chất màu nâu và c c t p kh c (nhƣ: chất éo,…). Điều đó đƣ c th hiện qua sự iến đổi màu của kh ng sinh: kh ng sinh thô an đầu có màu đỏ nâu, sau tinh chế lần 1 thì thu đƣ c kh ng sinh L1 màu đỏ tƣơi. Sau tinh chế lần 1, ta thu đƣ c c c phân đo n có HTKS cao nhất là từ 2 – 4 với khối lƣ ng là 0,3660g, tính ra đƣ c hiệu suất kh cao là 74,50%. Tuy nhiên, vết kh ng sinh ị kéo đuôi, chứng tỏ
53
không phải là m t thành phần kh ng sinh tinh khiết, mà là h n h p ít nhất hai thành phần kh ng sinh. Bởi vậy, ta tiếp tục tinh chế kh ng sinh lần 2.
Khi tinh chế kh ng sinh lần 2, an đầu, sau khi khảo s t, ta s dụng hệ Ethylacetat : Methanol = 30 : 1, trên sắc k lớp mỏng cho kết quả kh tốt: hai vết tròn với Rf chênh lệch nhau 0,08. Tuy nhiên, do Rf vẫn chƣa kh c xa nhau nhiều nên khi tiến hành sắc k c t ằng hệ này thì l i chƣa t ch đƣ c c c thành phần kh ng sinh. Do đó, ta khảo s t tiếp m t số dung môi nhằm cải tiến hệ Ethylacetat : Methanol = 30 : 1 và tìm ra n – hexan với tỉ lệ Ethylacetat : Methanol : n – hexan = 30 : 1 : 1. Nhờ vai trò của n – hexan, đ chênh lệch Rf của hai chất đã đƣ c kéo dài ra hơn, nên đã t ch đƣ c trên sắc k c t.
Tinh chế lần 2 ằng hệ dung môi Ethylacetat : Methanol : n – hexan = 30 : 1 : 1, ta thu đƣ c thành phần kh ng sinh 2 có HTKS rất m nh (là thành phần kh ng sinh chính) với khối lƣ ng 0,0700g, tính ra hiệu suất tinh chế từ kh ng sinh thô là 14,24%; tiếp đó là kh ng sinh 1 có HTKS yếu hơn với khối lƣ ng 0,0430g với hiệu suất tinh chế từ kh ng sinh thô là 8,75%. Ngoài ra, còn có m t thành phần kh ng sinh có HTKS yếu, nhƣng ta không xét ở đây.
Tuy nhiên, vẫn còn m t v ng xen phủ giữa kh ng sinh 1 và kháng sinh 2. Đây chính là nguyên nhân làm cho hiệu suất tinh chế kh ng sinh từ t kh ng sinh thô thấp . Do đó, đ tăng hiệu suất tinh chế kh ng sinh, ta tiếp tục sắc k c t v ng xen phủ ằng hệ dung môi Ethylacetat : Methanol : n – hexan = 30 : 1 : 1. Sau tinh chế lần a, hiệu suất tinh chế kh ng sinh đã đƣ c nâng cao. Cụ th là, hiệu suất tinh chế kháng sinh 1 và kháng sinh 2 từ kh ng sinh thô lần lƣ t là 10,44% và 18,93%. Nhƣ vậy, m t iện ph p đ đ t hiệu suất tinh chế kh ng sinh tối đa là sắc k c t ằng hệ Ethylacetat : Methanol : n – hexan = 30 : 1 : 1 cho đến khi v ng xen phủ gần nhƣ ằng 0.
4.3. Nghiên cứu cấu tr c chất kháng sinh chính
Về phổ UV, ta thấy kh ng sinh 2 (kh ng sinh chính) có 3 đỉnh hấp thụ ứng với 3 ƣớc sóng là 444,0 nm; 242,5 nm; 203,5 nm. C c đỉnh hấp thụ này tƣơng ứng với sự chuy n dịch điện t từ n lên π*. Trong đó, n là cặp điện t tự do (không liên
54
kết) ở c c dị nguyên t O, N, S, halogen. Nhƣ vậy, kháng sinh này là m t h p chất có chứa điện t n và liên kết π. Từ đó, ta dự đo n trong cấu tr c của kháng sinh 2 có nối đôi liên h p, dị tố hoặc có cả hai đặc đi m này [1, 15].
Phổ IR cho phép ta dự đo n c c nhóm chức đặc trƣng trong cấu tr c hóa học của kh ng sinh 2. C c ƣớc sóng hấp thụ cực đ i c ng c c nhóm chức dự đo n tƣơng ứng đƣ c tổng kết trong ảng 4.1 [15].
Bảng 4.1. Biện giải phổ IR của kh ng sinh 2 Đỉnh hấp thụ (cm-1) Nhóm chức đặc trƣng
3397,79; 3277,35; 3057,72 Liên kết –NH của amid hoặc amin thơm ậc 1, alcol ậc 3
2979,79 Liên kết –NH2 trong [R2NH2]+A- hoặc liên kết –CH m ch thẳng
2887,69 Liên kết –NH trong [R3NH]3+A-
1746,96 liên kết –C=O trong acid carboxylic mo-
nome
1654,47; 1579,32 Liên kết –C=O hoặc liên kết –C=C- liên h p
1478,16 Liên kết trong muối amoni NH4+ hoặc
liên kết –C=C- trong vòng thơm
1298,96 Liên kết của vài nhóm methyl –CH3 kết
h p c ng nguyên t C
1197,80 Liên kết –C-O trong alcohol
1096,64 Liên kết –C-O trong acid carboxylic
981,03 Liên kết =C-H ở m ch nh nh
819,17 Liên kết trong vòng furan
639,97 Liên kết C-X (với X= Cl, Br)
55
Nhƣ vậy, cấu tr c hóa học của kh ng sinh 2 hết sức phức t p với nhiều nhóm chức kh c nhau, do đó cần tiến hành iện giải thêm c c phổ khối, phổ c ng hƣởng từ h t nhân đ x c định đƣ c chính x c cấu tr c của ch ng.
Với phổ khối thu đƣ c, ta iết đƣ c khối lƣ ng phân t của kh ng sinh 2 chỉ kém actinomycin D m t proton. Biện giải phổ NMR của kh ng sinh 2 cho thấy, cấu tr c của kh ng sinh này có chứa nhân phenoxazone giống actinomycin D. Tuy nhiên, do h n chế về trình đ và thời gian nên chƣa kết luận đƣ c chính xác xem kh ng sinh 2 là chất gì.
56
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
Luận văn đã cơ ản hoàn thành c c mục tiêu đề ra. Cụ th nhƣ sau:
- Nâng cao đƣ c HTKS của chủng Streptomyces 166.28 thông qua sàng lọc tự nhiên và hai lần đ t iến ằng nh s ng UV, đặc iệt là trên S. flexneri.
- Nâng cao đƣ c hiệu suất chiết ằng m t trong hai iện ph p: phƣơng ph p chiết nhiều lần và phƣơng ph p thêm muối NaCl vào dịch lọc trƣớc khi chiết.
- Với qu trình tinh chế kh ng sinh: s dụng hệ Butylacetat: Acetone: Triethylamin = 1: 2: 1 đ lo i t p trong kh ng sinh thô và hệ Ethylacetat : Methanol : n – hexan = 30 : 1 : 1đ tinh chế ra hai kh ng sinh có ho t tính m nh là kh ng sinh 2, tiếp đó là kháng sinh 1. Nâng cao đƣ c hiệu suất tinh chế kh ng sinh sau lo i t p ằng sắc k c t ằng hệ Ethylacetat : Methanol : n – hexan = 30 : 1 : 1 hai lần.
- Đã nghiên cứu đƣ c c c đặc đi m sau về kh ng sinh 2 (là kh ng sinh chính): + Tinh th hình kim.
+ Màu đỏ cam.
+ Nhiệt đ nóng chảy: 2450C – 2460C.
+ Phổ UV có a đỉnh hấp thụ ở 444,0 nm; 242,5 nm; 203,5 nm với đ hấp thụ lần lƣ t là 0,117; 0,235; 0,852 cho iết trong cấu tr c có nối đôi liên h p, dị tố hoặc có cả hai đặc đi m này.
+ Phổ IR có nhiều đỉnh hấp thụ cho thấy cấu tr c rất phức t p với nhiều nhóm chức khác nhau.
+ Phổ khối cho iết khối lƣ ng phân t là 1254đvC.
+ Tìm ra nhân phenoxazone trong cấu tr c nhƣng chƣa kết luận đƣ c chính x c kháng sinh 2 là chất gì.
KIẾN NGHỊ
Từ c c kết quả đ t đƣ c từ luận văn, tôi xin kiến nghị nhƣ sau:
- Tiếp tục nâng cao HTKS ằng c c phƣơng ph p đ t iến kh c nhƣ: đ t iến hóa học (HNO2; nitrosoguanidin; dimethylsulfat), tia Rơnghen,…
57
- Tìm kiếm c ch tinh chế kh ng sinh nhanh hơn thay vì sắc k c t đến khi v ng xen phủ gần nhƣ ằng 0.
PHỤ LỤC
Hình P1: Hình ảnh x khuẩn sau đ t iến UV lần 1
Hình P2: Th HTKS c c iến chủng sau đ t iến UV lần 1 (VSV ki m định:
Hình P3: Th HTKS trong lên men chọn chủng (VSV ki m định: B.cereus)
Hình P5: Phổ UV của chất kh ng sinh 1
Hình P7: Phổ IR kh ng sinh 1
Hình P9: Phổ khối kh ng sinh 1
Hình P11: Phổ 1
Hình P14: Phổ 13
Hình P23: Phổ HMBC của kh ng sinh 2
Hình P25: Phổ HMBC giãn của kh ng sinh 2
Hình P27: Phổ HMBC giãn của kh ng sinh 2
Hình P29: Phố HSQC giãn của kh ng sinh 2