- Mục đích: Đ nâng cao hiệu suất tinh chế kh ng sinh 1 và kh ng sinh 2. - C ch tiến hành:
Sắc k c t tiếp v ng xen phủ của kh ng sinh 1 và kh ng sinh 2. Trƣớc hết, ta tiến hành sắc k c t v ng xen phủ mà kh ng sinh 2 là chủ yếu (c c phân đo n 10 – 16) ằng hệ Ethylacetat : Methanol : n – hexan = 30 : 1 : 1.
G p c c phân đo n 10 – 16 của tinh chế lần 2, cất quay chân không ở 460
C – 700C và -0,85atm đến hết dung môi, kết tinh thu đƣ c 0,2100g kháng sinh. Đem ch y sắc k c t với hệ Ethylacetat : Methanol : n – hexan = 30 : 1 : 1, các ƣớc tiến hành tƣơng tự nhƣ tinh chế lần 2, thu đƣ c 9 phân đo n.
- Kết quả: đƣ c trình ày ở ảng 3.16 và 3.17.
Bảng 3.16: Kết quả sắc k lớp mỏng c c phân đo n sau tinh chế lần 3 Phân đo n Số vết Đ đậm nh t của vết Rf vết 1 Rf vết 2
1 0 2 1 Đậm 0,66 3 2 Vết 1 nh t, vết 2 đậm 0,66 0,55 4 2 Vết 1 rất nh t, vết 2 đậm 0,66 0,55 5 1 Đậm 0,55 6 1 Đậm 0,55 7 1 Đậm 0,55 8 1 Nh t 0,55 9 0
Bảng 3.17: Kết quả th HTKS c c phân đo n sau tinh chế lần 3 (VSV ki m định: B. cereus)
45 Phân đo n D [mm] s 1 0 0 2 18,25 0,02 3 19,43 0,15 4 19,87 0,23 5 21,71 0,05 6 21,76 0,11 7 21,70 0,19 8 21,00 0,24 9 0 0
Sau khi kết tinh, ta thu thêm đƣ c 0,0230g kháng sinh 2 và 0,0083g kháng sinh 1. Nhƣ vậy, sau 3 lần tinh chế ta thu đƣ c 0,093g kh ng sinh 2 và 0,0513g kháng sinh 1. Tính hiệu suất sau a lần tinh chế ta có:
Hiệu suất tinh chế kh ng sinh 1 từ kh ng sinh L1 là H1-L1% = (0,0513/0,3660) x 100% = 14,02%
Hiệu suất tinh chế kh ng sinh 1 từ t kh ng thô là H1 = 74,50% x 14,02% = 10,44%
Hiệu suất tinh chế kh ng sinh 2 từ kh ng sinh L1 là H2-L1% = (0,093/0,3660) x 100% = 25,41%
Hiệu suất tinh chế kh ng sinh 2 từ t kh ng sinh thô là H2 = 74,50% x 25,41% = 18,93%
Do thời gian h n h p nên đề tài chƣa có điều kiện sắc k c t v ng xen phủ mà kh ng sinh 1 là chủ yếu (phân đo n 9 của tinh chế lần 2).
- Nhận xét:
Sau a lần sắc k c t, hiệu suất tinh chế kh ng sinh đã đƣ c nâng cao. Nhƣ vậy, sắc k c t cho đến khi v ng xen phủ gần nhƣ ằng 0 là m t iện ph p đ tăng hiệu suất tinh chế kh ng sinh 2 (là kh ng sinh chính) và kh ng sinh 1.
46 3.5. Kết quả đo đi m nóng chảy và phổ 3.5.1. Kết quả đo nhiệt đ nóng chảy
Ta đo nhiệt đ nóng chảy của kh ng sinh 1 và kh ng sinh 2 t i phòng thí nghiệm tổng h p hóa dƣ c thu c môn công nghiệp dƣ c. Kết quả nhƣ sau:
- Nhiệt đ nóng chảy của kh ng sinh 1: 2140C – 2160C. - Nhiệt đ nóng chảy của kh ng sinh 2: 2450C – 2460C. 3.5.2. Kết quả đo phổ t ngo i
Phổ t ngo i của kh ng sinh 1 và kh ng sinh 2 đƣ c đo t i môn Hóa l – Dƣ c l thu c Trƣờng Đ i Học Dƣ c Hà N i. Kết quả nhƣ sau:
- Phổ t ngo i của kh ng sinh 1 có 3 đỉnh hấp thụ ở ƣớc sóng 443,5 nm; 242,5 nm; 203,5 nm với đ hấp thụ lần lƣ t là 0,087; 0,222; 0,899.
- Phổ t ngo i của kh ng sinh 2 có 3 đỉnh hấp thụ ở ƣớc sóng 444,0 nm; 242,5 nm; 203,5 nm với đ hấp thụ lần lƣ t là 0,117; 0,235; 0,852.
Hình ảnh phổ t ngo i đƣ c th hiện trong phụ lục: hình P5 và hình P6. 3.5.3. Kết quả đo phổ hồng ngo i (IR)
Phổ IR của hai kh ng sinh đƣ c đo t i Viện Hóa học – Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam. Kết quả thu đƣ c nhƣ sau:
- Phổ IR của kh ng sinh 1 có c c đỉnh hấp thụ cực đ i t i c c ƣớc sóng sau: 3447,39 cm-1; 2965,62 cm-1 ; 2887,69 cm-1 ; 1748,23 cm-1; 1654,61 cm-1; 1581,47 cm-1; 1484,93 cm-1; 1303,54 cm-1; 1201,15 cm-1 ; 1098,76 cm-1 ; 981,73 cm-1; 642,37 cm-1 ; 560,45 cm-1.
- Phổ IR của kh ng sinh 2 có c c đỉnh hấp thụ cực đ i t i c c ƣớc sóng sau: 3397,79 cm-1; 3277,35 cm-1; 3057,72 cm-1; 2979,79 cm-1; 2887,69 cm-1 ; 1746,96 cm-1; 1654,47 cm-1; 1579,32 cm-1; 1478,16 cm-1; 1298,96 cm-1; 1197,80 cm-1; 1096,64 cm-1; 981,03 cm-1 ; 819,17 cm-1; 639,97 cm-1 ; 524,36 cm-1.
47 3.5.4. Kết quả đo phổ khối
Phổ khối của hai kh ng sinh đƣ c đo t i Viện Hóa học – Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam. Kết quả thu đƣ c nhƣ sau:
- Khối lƣ ng phân t dự kiến của kh ng sinh 1 là: 1268đvC. - Khối lƣ ng phân t dự kiến của kh ng sinh 2 là: 1254đvC.
Hình ảnh phổ khối đƣ c th hiện trong phụ lục: hình P9 và hình P10. 3.5.5. Kết quả đo phổ c ng hƣởng từ h t nhân
Ta tiến hành đo phổ c ng hƣởng từ h t nhân đối với thành phần kh ng sinh chính – kh ng sinh 2 gồm 6 lo i phổ: 1H NMR, 13C NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC t i Viện Hóa học – Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam. Hình ảnh phổ c ng hƣởng từ h t nhân đƣ c th hiện trong phụ lục: hình P11 – P30.
Với kết quả đo phổ khối ta có: khối lƣ ng phân t dự kiến của kh ng sinh 2 là 1254 đvC. So s nh với khối lƣ ng phân t của c c kh ng sinh có khối lƣ ng phân t trong khoảng 1000 – 1300 đvC, ta thấy kh ng sinh 2 chỉ kém actinomycin D m t proton (công thức phân t của actinomycin D là C62H87N12O16, khối lƣ ng phân t của nó là 1255đvC). Dƣới đây là cấu tr c hóa học của actinomycin D.
48
L-Meval: N-metyl-L-valine; Sar: sarcosine; L-Pro: L-proline; L-4-oxoPro: L-4-oxo-proline; D-Val: D-valine; L-Thr: L-threoline Hình 3.1. Cấu tr c hóa học của actinomycin D
Phổ 13C-NMR của kháng sinh 2 xuất hiện 12 tín hiệu t i 168,114; 168,358; 168,587; 168,786; 169,908; 170,105; 170,256; 175,006; 175,347; 175,483; 175,630 và 180,469 đi n hình cho sự có mặt của 12 nhóm C=O.
CH N H2C N CH N CH NH CH HN HC N CH2 N HC N CH HN HC NH O N O CH3 CH3 HA HB NH2 O O CH H3C CH 3 O O CH CH H3C H3C CH3 CH3 O O O O H2 C H2C H2C O CH3 O H3C CH H3C CH3 O CH2 H2 C CH2 O H3C O CH CH3 H3C CH3 O 1 2 3 4 4a 10a 5a 9a 6 7 8 9 L-MeVal Sar L-Pro D-Val L-Thr ring ring Phenoxazone ring L-MeVal Sar L-Pro D-Val L-Thr CH 1a
49
Mặt kh c, trên phổ NMR của kh ng sinh 2 xuất hiện c c tín hiệu của khung phenoxazone t i c 168,114 và 168,358 (2 x C=O), 103,040; 146,471; 180,469 (C=O), 114,244 (C), 146,471 (C), 141,787 (C), 126,434 (C), 130,646 (CH), 126,434 (CH), 131,310 (C), 129,104 (C), 15,027 (CH3) và 7,579 (CH3); và hai pro- ton olefin vị trí ortho t i H 7,484 và 7,543; và tín hiệu của hai nhóm methyl gắn vào vòng thơm t i H 2,19(6H). Dữ kiện phổ về khung phenoxazone của actinomy- cin D và kh ng sinh 2 đƣ c trình bày ở bảng 3.18.
Bảng 3.18: Dữ kiện phổ NMR về khung phenoxazone của actinomycin D (1) và kháng sinh 2 (2) 1 2 C C H C=O # 168,114 /168,358 - 1 101,6 103,040 - 2 146,0 146,471 - 3 179,1 180,469 - 4 113,5 114,244 - 4a 145,1 146,471 - 5a 140,5 141,787 - 6 127,5 126,434 - 7 130,2 130,646 7,484 8 125,9 126,434 7,543 9 132,6 131,310 - 9a 129,1 129,104 - 4-CH3 7,7 7,579 2,19 6-CH3 15,0 15,027 2,19
50
#: 13 nhóm C=O của actinomycin D [1] C = 166,1; 166,3; 2 x 166,5; 2 x 167,6; 168.5; 168,9; 3 x 173,3; 173,7, 179,1.
Nhƣ vậy, kháng sinh 2 là h p chất chứa nhân phenoxazone. Song chƣa th x c định chính xác kháng sinh 2 là chất gì.
51
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN
4.1. Nâng cao HTKS ằng chọn lọc, cải t o giống
Qua qu trình chọn lọc và cải t o giống ằng đ t iến UV, HTKS của chủng
Streptomyces 166.28 tăng lên rõ rệt so với an đầu.
Bằng phƣơng ph p SLNN, ta thu đƣ c m t số d ng chủng có HTKS cao, đặc iệt là d ng chủng 6. Kết quả này có đƣ c là do trong quần th , có sự iến dị tự nhiên theo c c tần số kh c nhau, trong đó có c c c th có ho t tính kh ng sinh m nh gấp 1,1-1,2 lần những c th kh c.
Sau khi đ t iến UV lần 1, với đ sống sót 0,29%, ta thu đƣ c đa phần là c c iến chủng có % iến đổi ho t tính dƣơng, ên c nh đó c ng có m t số iến chủng có % iến đổi ho t tính âm. Trong c c iến chủng có % iến đổi ho t tính dƣơng, l i có sự iến đổi kh c nhau về t c dụng của c c iến chủng. Cụ th là, có iến chủng tăng HTKS đồng đều cả trên S. flexneri và B. cereus (cao nhất là iến chủng 6.12: tăng 112,20% trên S. flexneri và tăng 110,06% trên B. cereus so với mẫu chứng); có iến chủng chỉ tăng HTKS trên S. flexneri mà không tăng trên B. cereus
(đi n hình nhất là iến chủng 6.11 : tăng 116,90% trên S. flexneri và giảm ho t tính trên B. cereus so với mẫu chứng); có iến chủng chỉ tăng HTKS trên B. cereus mà không tăng trên S. flexneri ( iến chủng đ i diện là 6.26: tăng 110,85% trên B. cere- us và giảm HTKS trên S. flexneri). Điều này đƣ c giải thích là do nh s ng UV t c đ ng vào chu i ADN gây ra sự iến đổi ho t tính kh c nhau giữa c c iến chủng.
Đối với đ t iến lần 2, ta hƣớng về t c dụng chọn lọc trên S. flexneri, nên đã tiến hành đ t iến tiếp iến chủng 6.11 với đ sống sót tính to n đƣ c là 0,17%. Tuy nhiên, trong c c iến chủng có % iến đổi ho t tính dƣơng thì đa số đều tăng ho t tính cả trên S. flexneri và B. cereus. Trong đó chỉ có iến chủng 11.11 tăng ho t tính nhiều nhất trên S. flexneri và ít nhất trên B. cereus với % iến đổi ho t tính lần lƣ t là 112,16% và 101,95%. Tuy nhiên, đ thu đƣ c iến chủng có t c dụng chọn lọc tốt hơn trên S. flexneri, cần th nghiệm c c phƣơng ph p đ t iến kh c:
52
đ t iến hóa học (HNO2; nitroguanin; dimethylsulfat), tia Rơnghen,… Do thời gian nghiên cứu h n h p nên đề tài chƣa có điều kiện tiến hành c c phƣơng ph p này. 4.2. Nâng cao hiệu suất chiết t ch kh ng sinh
Bằng việc cải tiến qu trình chiết t ch, ta đã nâng cao đƣ c hiệu suất chiết tách kháng sinh, thu đƣ c c c thành phần kh ng sinh tinh khiết.
Khi thực hiện chiết xuất, kh ng sinh đƣ c chuy n từ pha nƣớc sang pha dung môi hữu cơ nên đã lo i đƣ c c c t p chất tan trong nƣớc. Có hai dung môi chiết kh ng sinh từ dịch lọc tốt nhất là n – butanol và ethylacetat đều ở pH 3. Tuy nhiên, s dụng ethylacetat ƣu việt hơn vì thời gian cất quay ngắn hơn nhiều, tiết kiệm chi phí cất quay hơn so với n – butanol. Điều này đƣ c giải thích là do nhiệt đ sôi của ethylacetat (khoảng 70,40C) thấp hơn nhiều so với nhiệt đ sôi của n – butanol (khoảng 1170C - 1180C). Nên ta chọn ethyacetat là dung môi chiết xuất kh ng sinh. Tuy vậy, chiết kh ng sinh ằng ethylacetat, pha nƣớc vẫn còn HTKS, chứng tỏ kh ng sinh chƣa đƣ c chiết kiệt khỏi pha nƣớc. Đ nâng cao hiệu suất chiết, có hai iện ph p đã đƣ c th nghiệm. Biện ph p thứ nhất là s dụng phƣơng ph p chiết nhiều lần, ta thấy: sau 3 lần chiết thì kh ng sinh đã đƣ c chiết kiệt sang pha ethylacetat. C ch này dễ tiến hành song gây tốn thời gian và dung môi chiết. Do đó, c ch thứ hai đã đƣ c đề xuất là thêm muối NaCl vào dịch lọc trƣớc khi chiết, với lƣ ng thêm 20g/500ml. Ta nhận thấy sau 1 lần chiết thì kh ng sinh đã đƣ c chiết kiệt sang pha ethylacetat. Cơ chế có th đƣ c giải thích là do muối làm tăng sự chuy n pha của kháng sinh.
Sau khi chiết xuất, kh ng sinh đƣ c tinh chế đ tiếp tục lo i t p. Với lần tinh chế thứ nhất, ằng việc s dụng hệ Butylacetat: Acetone: Triethylamin = 1: 2: 1, ta đã lo i đƣ c t p chất màu nâu và c c t p kh c (nhƣ: chất éo,…). Điều đó đƣ c th hiện qua sự iến đổi màu của kh ng sinh: kh ng sinh thô an đầu có màu đỏ nâu, sau tinh chế lần 1 thì thu đƣ c kh ng sinh L1 màu đỏ tƣơi. Sau tinh chế lần 1, ta thu đƣ c c c phân đo n có HTKS cao nhất là từ 2 – 4 với khối lƣ ng là 0,3660g, tính ra đƣ c hiệu suất kh cao là 74,50%. Tuy nhiên, vết kh ng sinh ị kéo đuôi, chứng tỏ
53
không phải là m t thành phần kh ng sinh tinh khiết, mà là h n h p ít nhất hai thành phần kh ng sinh. Bởi vậy, ta tiếp tục tinh chế kh ng sinh lần 2.
Khi tinh chế kh ng sinh lần 2, an đầu, sau khi khảo s t, ta s dụng hệ Ethylacetat : Methanol = 30 : 1, trên sắc k lớp mỏng cho kết quả kh tốt: hai vết tròn với Rf chênh lệch nhau 0,08. Tuy nhiên, do Rf vẫn chƣa kh c xa nhau nhiều nên khi tiến hành sắc k c t ằng hệ này thì l i chƣa t ch đƣ c c c thành phần kh ng sinh. Do đó, ta khảo s t tiếp m t số dung môi nhằm cải tiến hệ Ethylacetat : Methanol = 30 : 1 và tìm ra n – hexan với tỉ lệ Ethylacetat : Methanol : n – hexan = 30 : 1 : 1. Nhờ vai trò của n – hexan, đ chênh lệch Rf của hai chất đã đƣ c kéo dài ra hơn, nên đã t ch đƣ c trên sắc k c t.
Tinh chế lần 2 ằng hệ dung môi Ethylacetat : Methanol : n – hexan = 30 : 1 : 1, ta thu đƣ c thành phần kh ng sinh 2 có HTKS rất m nh (là thành phần kh ng sinh chính) với khối lƣ ng 0,0700g, tính ra hiệu suất tinh chế từ kh ng sinh thô là 14,24%; tiếp đó là kh ng sinh 1 có HTKS yếu hơn với khối lƣ ng 0,0430g với hiệu suất tinh chế từ kh ng sinh thô là 8,75%. Ngoài ra, còn có m t thành phần kh ng sinh có HTKS yếu, nhƣng ta không xét ở đây.
Tuy nhiên, vẫn còn m t v ng xen phủ giữa kh ng sinh 1 và kháng sinh 2. Đây chính là nguyên nhân làm cho hiệu suất tinh chế kh ng sinh từ t kh ng sinh thô thấp . Do đó, đ tăng hiệu suất tinh chế kh ng sinh, ta tiếp tục sắc k c t v ng xen phủ ằng hệ dung môi Ethylacetat : Methanol : n – hexan = 30 : 1 : 1. Sau tinh chế lần a, hiệu suất tinh chế kh ng sinh đã đƣ c nâng cao. Cụ th là, hiệu suất tinh chế kháng sinh 1 và kháng sinh 2 từ kh ng sinh thô lần lƣ t là 10,44% và 18,93%. Nhƣ vậy, m t iện ph p đ đ t hiệu suất tinh chế kh ng sinh tối đa là sắc k c t ằng hệ Ethylacetat : Methanol : n – hexan = 30 : 1 : 1 cho đến khi v ng xen phủ gần nhƣ ằng 0.
4.3. Nghiên cứu cấu tr c chất kháng sinh chính
Về phổ UV, ta thấy kh ng sinh 2 (kh ng sinh chính) có 3 đỉnh hấp thụ ứng với 3 ƣớc sóng là 444,0 nm; 242,5 nm; 203,5 nm. C c đỉnh hấp thụ này tƣơng ứng với sự chuy n dịch điện t từ n lên π*. Trong đó, n là cặp điện t tự do (không liên