2.1.1. Nguyên vật liệu
Chủng x khuẩn: chủng Streptomyces 166.28 do B môn Vi sinh – Sinh học trƣờng Đ i học Dƣ c Hà N i cung cấp.
Chủng vi sinh vật ki m định: do B môn Vi sinh – Sinh học cung cấp, đƣ c trình ày ở ảng 2.1 dƣới đây.
Bảng 2.2: Các VSV ki m định
Vi khuẩn Gram(+) Vi khuẩn Gram(-)
Bacillus cereus ATCC 9946 Escherichia coli ATCC 25922 Bacillus pumilus ATCC 6633 Proteus mirabilis BV 108
Bacillus subtilis ATCC 6633 Pseudomonas aeruginosa VM 201 Sarcina lutea ATCC 9341 Salmonela typhi DT 220
Staphylococcus aureus ATCC 1228 Shighella flexneri DT 112
Môi trƣờng
Các MT nuôi cấy x khuẩn: đƣ c trình ày ở ảng 2.2.
Các MT lên men (MTdt): có thành phần tƣơng ứng MT nuôi cấy x khuẩn nhƣng lo i ỏ th ch.
Các MT nuôi cấy VSV ki m định: đƣ c trình ày ở ảng 2.3. Bảng 3.2: C c MT nuôi cấy x khuẩn
Thành phần Đơn vị MT2 Tinh t G 2 KCl G 0,05 NaNO3 G 0,2 K2HPO4 G 0,1 MgSO4.7H2O G 0,05 Th ch G 2 Nƣớc Ml 100
19
pH 6,8-7,2
Bảng 2.4: C c MT nuôi cấy VSV ki m định
Thành phần NaCl Cao thịt Pepton Th ch pH
% % % %
MT canh thang 0,5 0,3 0,5 0
7,0-7,4
MT th ch thƣờng 0,5 0,3 0,5 1,8
Dung môi: đƣ c trình ày ở ảng 2.4 dƣới đây.
Bảng 2.5: Các dung môi s dụng
Dung môi Khối lƣ ng riêng (g/ml) Nhiệt đ sôi (°C)
Aceton 0,79 56 Acetonitril 0,782-0,783 80-82 n-Butanol 0,81 117,4 Butylacetat 0,880-0,885 117-118 Cloroform 1,470-1,480 60-62 Diclorometan 1,32 40 Dimethylformamid 0,95 153 Ethanol 0,789-0,791 78,3 Ethylacetat 0,889-0,901 70,4 Methanol 0,791-0,793 64,5 Triethylamin 0,726-0,728 90 Vật liệu ch y sắc k - Bản mỏng sắc k : Silicagel 60 F254, Merck.
- Dung môi ch y sắc k : C c dung môi trong ảng 2.4 ở trên.
- Bình ch y sắc k , uret, Silicagel 60 F254 h t có đƣờng kính 0,040 - 0,063mm.
20 2.1.2. M y móc thiết ị
- T c nhân gây đ t iến: nh s ng UV (λ=254nm), nguồn phát Toshiba 60W, điện thế 220V.
- M y lắc Taitec Bio – Shaker BR 300 Lf.
- Tủ ấm Memmert IBN 400, Binder CE BD 53, tủ ấm Trung Quốc. - Tủ l nh Samsung, tủ l nh Sanyo.
- Tủ cấy vô tr ng Aura VF 48, tủ cấy BASSAIR. - Tủ sấy Shalla model – 1350FX.
- Lò vi sóng Whirlpool.
- Nồi hấp vô tr ng Hirayama Model HL3030e, nồi hấp Hirayama HicliveTMHve - 25, nồi hấp ALPKT2346.
- Cân k thuật Precisa BJ 210C. - Cân phân tích Sartorius BP 121J. - M y đo nhiệt đ nóng chảy E2-Melt - M y cất quay Buchi Water ath B480. - Kính hi n vi điện t .
- Thƣớc k p Palmer đ chính x c 0,02mm. - H p Petri đƣờng kính 9cm.
- Buret, ình chiết, patuyn, pipet c c lo i, ống nghiệm, ình nón, ống đong, cốc có mỏ c c lo i,…
2.2. Phƣơng ph p thực nghiệm
2.2.1. Phƣơng ph p nuôi cấy và giữ giống x khuẩn
- Cấy zigzac x khuẩn trên ống th ch nghiêng có chứa môi trƣờng nuôi cấy thích h p, ủ cho ph t tri n ở 28-29°C.
- Sau 6 - 10 ngày, x khuẩn đã ph t tri n tốt, cho c c ống giống vào tủ l nh ảo quản ở 2-4°C, định kỳ 3-6 th ng cấy truyền m t lần.
21
2.2.2. Đ nh gi ho t tính kh ng sinh ằng phƣơng ph p khuếch t n
- Nguyên tắc: Đƣa mẫu th lên trên ề mặt lớp th ch dinh dƣ ng đã cấy VSV ki m định. Kh ng sinh từ mẫu th khuếch t n vào MT th ch sẽ ức chế sự ph t tri n của VSV ki m định và t o thành vòng vô khuẩn.
- Tiến hành: gồm 5 ƣớc chính.
+ Bƣớc 1: T o h n dịch VSV ki m định.
Lấy m t vòng que cấy VSV ki m định cấy vào 2,5 ml MT canh thang, ủ ở 37°C trong 18-24h (đối với vi khuẩn) đ t o thành h n dịch VSV có nồng đ 106-108 tế bào/ml.
+ Bƣớc 2: Cấy h n dịch VSV ki m định vào môi trƣờng th ch thƣờng đã tiệt tr ng đƣ c đ ngu i đến 45-50°C với tỷ lệ 5:200 (105 tế ào/1ml), lắc đều, đổ vào c c đĩa Petri vô tr ng với th tích 20ml/đĩa.
+ Bƣớc 3: Đƣa mẫu th vào h p Petri có chứa môi trƣờng ki m định. Có 3 cách sau:
Phƣơng ph p khoanh giấy lọc: d ng đ th ho t tính của c c dịch chiết dung môi kh ng sinh dễ ay hơi.
- Cách làm: Khoanh giấy lọc (Φ=6,0mm) đã đƣ c tẩm 3 lần dịch chiết dung môi hữu cơ của mẫu th , đ khô tự nhiên ở nhiệt đ phòng hay sấy khô ở nhiệt đ dƣới 50ºC, sau đó đặt lên ề mặt môi trƣờng đã cấy VSV ki m định.
Phƣơng ph p khối th ch: th ho t tính kh ng sinh của chủng x khuẩn khi đƣ c nuôi cấy trên môi trƣờng đặc.
C ch làm: Đặt khối th ch (Φ=6,0mm) có chứa VSV sinh kh ng sinh lên ề mặt MT đã cấy VSV ki m định.
Phƣơng ph p giếng th ch: th ho t tính của kh ng sinh trong dung dịch.
C ch làm: Đục c c giếng th ch (Φ=6,0mm) trên MT đã cấy VSV ki m định, tiếp đó, nhỏ 0,05ml dịch th vào m i giếng.
22
Sau khi đặt mẫu th , c c đĩa Petri đƣ c đ trong tủ ấm ở 370C trong 18 – 24 giờ, rồi lấy ra đo đƣờng kính vòng vô khuẩn.
+ Bƣớc 5: Đ nh gi kết quả.
Đo đƣờng kính vòng vô khuẩn ằng thƣớc k p Palmer có đ chính x c 0,02mm. Kết quả đƣ c đ nh gi dựa trên đƣờng kính vòng vô khuẩn trung ình và đ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh theo công thức:
2 1 1 ( ) 1 n n i i i i D D D D s n n Trong đó:
D(mm): Đƣờng kính trung ình vòng vô khuẩn,
i
D (mm): Đƣờng kính vòng vô khuẩn thứ i, s: Đ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh,
n: Số thực nghiệm tiến hành song song (thông thƣờng: n=3). 2.2.3. Phƣơng ph p sàng lọc ngẫu nhiên (SLNN)
- Pha h n dịch ào t : Lấy m t vòng que cấy ào t Streptomyces 166.28,
cho vào ống nghiệm chứa 10ml nƣớc cất vô tr ng, lắc cho ào t phân t n đều, thu đƣ c h n dịch ào t ở đ pha loãng 10-1
(định ƣớc). Sau đó, pha loãng tƣơng tự đến nồng đ 10-6 ằng nƣớc cất vô tr ng.
- Cấy ào t : Cấy ào t Streptomyces 166.28 ở c c đ pha loãng 10-4 đến 10-6 lên môi trƣờng MT2 trong đĩa Petri. M i nồng đ pha loãng làm 3 thí nghiệm song song, rồi đem ủ ở 280C – 290C trong 6 ngày.
- Tiến hành chọn lọc ngẫu nhiên: Chọn tối thi u 32 khuẩn l c ph t tri n đặc th , mọc riêng rẽ đem cấy zigzac lên ề mặt MT2 trong đĩa Petri, rồi ủ ở 280
C – 290C trong 6 ngày. Sau đó lấy ra th ho t tính kh ng sinh (HTKS) ằng phƣơng ph p khối th ch.
2.2.4. Phƣơng ph p đ t iến (ĐB) ằng nh s ng UV
- Pha h n dịch ào t : Lấy m t vòng que cấy ào t Streptomyces 166.28,
23
đƣ c h n dịch ào t ở đ pha loãng 10-1 (định ƣớc). Sau đó d ng 1ml h n dịch ào t này pha loãng đến nồng đ 10-6
làm mẫu chứng, 9ml còn l i đƣ c đƣa vào đĩa Petri vô tr ng đ tiến hành đ t iến ằng nh s ng UV.
- Đ t iến ằng ánh sáng UV: với c c thông số là ƣớc sóng: λ=254nm; khoảng c ch chiếu: 60cm; thời gian chiếu: 5 ph t. Sau đó, lấy đĩa Petri ra, đ ch tối 2h, rồi pha loãng đến nồng đ 10-4, 10-5.
- Cấy c c ào t sau đ t iến: Cấy c c ào t sau đ t iến ở hai nồng đ là 10-4, 10-5 lên môi trƣờng MT2 trong đĩa Petri. Mẫu chứng: cấy ào t ở nồng đ 10-
6. M i nồng đ pha loãng làm 3 đĩa song song. C c đĩa Petri sau khi cấy đƣ c ủ ở nhiệt đ 280
C – 290C trong 6 – 10 ngày cho xuất hiện c c khuẩn l c. Đếm c c khuẩn l c, x c định % đ sống sót theo công thức:
% đ sống sót = (Nm/N0) × 10-6+k×100%
Trong đó: Nm: Số khuẩn l c sau đ t iến có nồng đ 10-k
, No: Số khuẩn l c trong mẫu chứng.
- Tiến hành sàng lọc với c c khuẩn l c sau khi đ t iến tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp sàng lọc ngẫu nhiên. Chú ý: làm song song mẫu chứng.
Phần trăm iến đổi ho t tính đƣ c x c định theo công thức: % iến đổi ho t tính = i 100% o D D Trong đó: i
D : Đƣờng kính trung ình vòng vô khuẩn của iến chủng thứ i sau đ t iến,
o
D : Đƣờng kính trung ình vòng vô khuẩn của mẫu chứng.
- Dựa vào kết quả thu đƣ c, lựa chọn ra c c iến chủng có % iến đổi ho t tính (+) cao nhất d ng cho c c nghiên cứu tiếp theo.
2.2.5. Phƣơng ph p lên men chìm tổng h p kh ng sinh
- Nguyên tắc: Sau khi x c định đƣ c c c môi trƣờng nuôi cấy ề mặt tối ƣu cho việc sản xuất kh ng sinh, ta s dụng giống cấp I đ lên men mẻ trên m y lắc trong c c môi trƣờng lỏng tƣơng ứng.
24
+ T o giống cấp I: Chủng giống Streptomyces 166.28 sau khi nuôi cấy trên th ch nghiêng (MT2) đủ 6 - 10 ngày tuổi đƣ c cấy vô tr ng sang bình nón 500ml chứa 100ml MT2dt ằng 10ml nƣớc vô tr ng, lắc trên m y lắc tròn ở nhiệt đ 28°C ± 0,1°C, tốc đ quay 140 vòng/ph t trong 48 giờ.
+ Lên men: Cấy vô tr ng giống cấp I sang c c ình nón chứa môi trƣờng dinh dƣ ng cần nghiên cứu với tỉ lệ Vgiống : Vmôi trƣờng = 1 : 10. Đƣa c c ình lên men trên vào m y lắc với c c thông số là nhiệt đ : 28°C ± 0,1°C; tốc đ quay: 140 vòng/ph t; thời gian: 120 giờ. Sau đó lựa chọn chủng cho dịch lên men có HTKS tốt nhất [4, 30].
2.2.6. Phƣơng ph p chiết kh ng sinh từ dịch lên men ằng dung môi hữu cơ
- Mục đích: X c định dung môi và pH chiết tối ƣu cho dịch lọc.
- Tiến hành: D ng phƣơng ph p chiết 1 lần.
+ Chỉnh pH ằng dung dịch NaOH 1M và HCl 1M.
+ Chiết dịch lọc đã chỉnh pH với nhiều dung môi kh c nhau: Dịch lọc và dung môi cho vào ình g n theo tỷ lệ Vdung môi:Vdịch lọc = 1:5. Sau đó lắc k trong 1 - 2 ph t. Đ yên 1h cho phân lớp. Sau đó, t ch riêng lấy lớp dung môi và dịch lọc.
+ Sau m i lần chiết, lấy lớp dung môi và lớp dịch lọc th ho t tính kh ng sinh theo phƣơng ph p khoanh giấy lọc, từ đó chọn đƣ c dung môi và pH chiết tối ƣu.
2.2.7. Phƣơng ph p t ch c c thành phần trong kh ng sinh ằng sắc k lớp mỏng
- Mục đích: X c định c c thành phần kháng sinh trong dịch lọc hoặc ki m tra đ tinh khiết của kh ng sinh.
- Tiến hành:
+ Cắt ản mỏng có kích thƣớc thích h p, ho t hóa ở 110°C/30 ph t.
+ Pha h n h p dung môi theo đ ng tỷ lệ, cho vào ình sắc k , đ ổn định khoảng 30 ph t.
25
+ D ng ống mao quản đƣờng kính 0,5mm chấm dung dịch cần sắc k lên ản mỏng đã ho t hóa sao cho c ch mép dƣới 1,5 cm rồi đ khô tự nhiên hoặc sấy ở nhiệt đ dƣới 50°C.
+ Đặt ản mỏng vào ình sắc k , khi dung môi ch y đƣ c khoảng 3/4 chiều dài ản mỏng thì lấy ra, đ nh dấu vết dung môi ch y.
+ X c định vết theo c c phƣơng ph p sau:
Soi đ n t ngo i: Đặt ản mỏng sắc k vào đ n t ngo i, nếu có vết chất th sẽ hiện màu.
Phƣơng ph p hiện hình VSV: Đặt ản mỏng vào đĩa Petri đã tiệt trùng, đổ m t lớp vừa phải MT th ch thƣờng đã cấy VSV ki m định sao cho ản mỏng chìm trong th ch. Đ vào tủ 37°C, ủ trong 18-24h. Nếu thấy xuất hiện vòng vô khuẩn chứng tỏ có vết kh ng sinh.
Phƣơng ph p hiện màu hóa học: Bản mỏng đƣ c phun thuốc th hiện màu, sấy ở 70°C trong 10 ph t đ ph t hiện vết. D ng thuốc th ninhydrin 1% trong cồn đ ph t hiện c c kh ng sinh có chứa nhóm amin.
Phƣơng ph p d ng mắt thƣờng: Quan s t ằng mắt thƣờng và tính to n kết quả. + Tính hệ số Rf (Retardation factor): f a R b
Trong đó: a: Khoảng c ch từ v ch xuất ph t đến tâm của vết ho t chất, : Khoảng c ch từ v ch xuất ph t đến v ch dung môi [2]. 2.2.8. Phƣơng ph p thu kh ng sinh thô ằng phƣơng ph p cất quay
Pha dung môi hữu cơ thu đƣ c sau khi chiết đƣ c cất cô ằng m y cất quay chân không ở 460C – 700C và -0,85atm. Cắn thu đƣ c đƣ c hòa tan ằng m t lƣ ng nhỏ methanol, đổ vào ình nón s ch, sấy ở 50°C đến khô. C o, thu lấy t kh ng sinh thô.
26
2.2.9. Phƣơng ph p tinh chế kh ng sinh thô ằng sắc k c t
- Chuẩn ị c t sắc k : C t có đƣờng kính 1cm, dài 50cm đƣ c r a s ch, tr ng cồn, sấy khô. Cân 8g h t Silicagel nhồi c t, ho t hóa ở 110°C trong 30 phút, đem hòa thành h n dịch với dung môi ch y và đƣa lên c t, ổn định c t trong 30 phút.
- Đƣa mẫu th lên c t: B t kh ng sinh thô hòa tan trong m t lƣ ng tối thi u methanol rồi tr n với khoảng 2g silicagel đã ho t hóa. Sau đó, sấy ở 50°C – 600C cho ay hết methanol rồi cho lên c t đã đƣ c ổn định.
- Cho dung môi ch y qua c t với tốc đ 0,5ml/ph t. Lấy c c phân đo n vào ống nghiệm s ch, khoảng 30 phân đo n, m i phân đo n 5ml.
- Th HTKS của c c phân đo n ằng phƣơng ph p khoanh giấy lọc. C c phân đo n có HTKS đƣ c tiến hành sắc k lớp mỏng với hệ dung môi t ch tốt nhất. Phân đo n chính là c c phân đo n có Rf tƣơng đƣơng nhau và có ho t tính kh ng sinh m nh.
- Các phân đo n chính sau khi ch y c t đƣ c cất chân không. C o thu t tinh th kh ng sinh cho vào ống nghiệm s ch, rồi đem kết tinh l i ằng h n h p dung môi, lọc, sấy khô ở 50°C đ thu kh ng sinh tinh khiết.
2.2.10. Phƣơng ph p x c định c c phổ nghiên cứu cấu tr c kháng sinh chính
C c phổ kh c nhau cho iết c c thông tin kh c nhau về kh ng sinh, từ đó ta có th iện giải đƣ c cấu tr c chất kh ng sinh chính. Cụ th nhƣ sau:
- Phổ t ngo i: cho iết thông tin về lo i h p chất.
- Phổ hồng ngo i: i u thị sự liên quan giữa nhóm chức và đỉnh hấp phụ. - Phổ khối ESI MS: nghĩa quan trọng nhất của nó là x c định đƣ c chính x c
khối lƣ ng phân t .
- Phổ c ng hƣởng từ h t nhân 1H (1H NMR), phổ c ng hƣởng từ 13C (13C NMR): x c định số lƣ ng hydro và car on.
- Phổ c ng hƣởng từ DEPT: x c định số nhóm CH3, CH và CH2. - Phổ c ng hƣởng từ COSY: i u thị tƣơng t c H H kề nhau. - Phổ c ng hƣởng từ HSQC: i u thị liên kết H – C.
27
- Phổ c ng hƣởng từ HMBC: i u thị tƣơng t c H – C trƣờng lập th .
Khi đã x c định đƣ c tất cả c c phổ cần thiết song việc iện giải cấu tr c hóa học của kh ng sinh là rất phức t p.
28
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Kết quả chọn lọc và cải t o giống 3.1.1. Sàng lọc ngẫu nhiên