4. Nội dung nghiên cứu
2.3. CHIẾT VÀ CÔ MẪU
2.3.1. Chiết mẫu
Lấy 20 g mẫu đông lạnh cho vào bình nón. Cho thêm 50 ml axeton vào mẫu thử và chiết bằng cách lắc kỹ trong 15 phút trên máy lắc. Sau đó thêm 50 ml ete dầu mỏ và lắc lại trong 15 phút. Lặp lại bƣớc chiết lần nữa với 50 ml ete dầu mỏ. Thu lấy dịch chiết vào ph u tách dung tích 2 lit và loại bỏ axeton bằng cách lắc hai lần với mỗi lần 500 ml nƣớc. Làm khô dịch chiết bằng natri sulfat khan và chuyển dịch chiết đã làm khô vào bình ngƣng tụ. Tráng natri sulfat ba lần bằng 10 ml ete dầu mỏ và gộp dung dịch rửa vào dịch chiết.
2.3.2.Cô đặc
Cho mảnh sôi vào dịch chiết và cô đặc dịch chiết đến còn khoảng 10 ml. Chuyển dịch chiết đã cô đặc vào ống nghiệm hiệu chuẩn và cô đặc tiếp đến 1 ml dùng dòng khí nitơ thổi nh đến nhiệt độ phòng.
2.4. LÀM SẠCH DỊCH CHIẾT
Chuẩn bị cột hấp phụ bằng cách đặt một cái nút nhỏ làm bằng sợi thạch anh vào ống sắc ký và nhồi, làm khô với 2,0 g 0,1 g oxit nhôm.
Trƣớc khi sử dụng, cách thức rửa giải cho mỗi dãy cột oxit nhôm và thể tích dung dịch rửa giải cần dùng phải đƣợc kiểm chứng bằng dung dịch chuẩn OCP.
Dùng pipet, chuyển dịch chiết vào cột hấp phụ đã đƣợc nhồi và làm khô, rửa ống thử nghiệm hai lần bằng 1 ml ete dầu mỏ và chuyển dịch rửa vào cột bằng pipet cùng loại ngay khi mức chất lỏng chạm đến mặt trên cột nhồi. Rửa giải dùng khoảng 20 ml ete dầu mỏ.
Chia dung dịch rửa giải thành là hai phần bằng nhau và một phần lƣu giữ cho phân tích dịch chiết đƣợc pha loãng cho sau này. Cô đặc phần còn lại bằng dòng nitơ thổi nh , không cần đun nóng, tới thể tích cuối cùng khoảng 1ml.
Cho vào dịch chiết cuối cùng 10 l dung dịch bơm chuẩn có nồng độ gấp 100 lần dung dịch bơm chuẩn có 1 ml trong dung dịch chuẩn làm việc nghĩa là tƣơng đƣơng với 1 ml dung dịch chuẩn làm việc.
2.5. TÁCH OCP KHÔNG PHÂN CỰC RA KHỎI MỘT SỐ OCP PHÂN CỰC BẰNG SẮC KÝ CỘT
Trong trƣờng hợp mẫu phức tạp, việc phân tách bằng phân tích sắc ký khí có thể không hoàn toàn. Trong trƣờng này cần phân tách bằng cách sắc ký bổ sung sử dụng toàn bộ dịch chiết đã cô đặc.
Toàn bộ dịch chiết đã đƣợc phân tách bằng sắc ký cột silicagel thành hai phần. Phần thứ nhất chứa OCP không phân cực (HCB, p,p’-DDT, heptaclo, aldrin). Phần thứ hai chứa nhiều OCP phân cực hơn (α-HCH, β- HCH, γ-HCH, đielrin, endrin, o,p’-DDD). Kiểm tra cách thức rửa giải bằng dung dịch chuẩn OCP.
Tách dịch chiết nhƣ sau: đặt một cái nút nhỏ bằng sợi thạch anh vào ống sắc ký. Đậy nút và làm khô bằng (1,5 g 0,1 g) silicagel và phủ 1 cm natri sulfat lên trên. Dùng pipet chuyển dịch chiết đã cô đặc vào cột đã chuẩn bị và làm khô. Tráng ống nghiệm hai lần, mỗi lần 1 ml hexan. Dùng cùng pipet chuyển dung dịch tráng vào cột ngay khi mức chất lỏng chạm tới đƣờng rìa trên của cột nhồi. Rửa giải bằn cách lần lƣợt thêm vào cột 25 ml hexan (phần 1) và 25 ml hỗn hợp hexan và ete đietyl (tỉ lệ thể tích 75:25) (phần 2).
Chia mỗi dung dịch rửa giải thành hai phần bằng nhau, và đối với từng phần dung dịch rửa giải, lƣu giữ lại một phần cho các phân tích. Làm bay hơi hai phần riêng biệt trong ống nghiệm có dung tích 1 ml.
Cho vào dịch chiết cuối cùng 10 l dung dịch bơm chuẩn có nồng độ gấp 100 lần dung dịch bơm chuẩn có 1 ml trong dung dịch chuẩn làm việc nghĩa là tƣơng đƣơng với 1 ml dung dịch chuẩn làm việc.
2.6. CÁC THÔNG SỐ VẬN HÀNH MÁY SẮC KÝ
Thiết bị sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) – GCMS-QP2010-PLUS
Dựa vào TCVN 8061:2009 (ISO 10382:2002) các thông số kĩ thuật của GC đƣợc cài đặt nhƣ sau cho toàn bộ các thí nghiệm:
2.6.1. Điều ki n sắc ký khí (GC) 2.6.1.1. Điều ki n buồng tiêm mẫu
- Injection Temp (Nhiệt độ buồng tiêm) 250oC
- Injection mode (Chế độ tiêm mẫu) Splitless
- Injection volume (Thể tích tiêm) 1µL
- Column flow (Tốc độ dòng cột) 1,20 ml/phút
- Pressure ( p suất đầu) 90,0 kPa - Total flow (Tổng dòng khí) 52,4 ml/ phút
2.6.1.2. Chƣơng trình nhi t độ lò cột Tốc độ
(oC/phút)
Nhi t độ (oC)
Thời gian giữ (phút)
- 100,0 2,00
7,00 300,0 5,00
2.6.2. Điều ki n khối phổ (MS)
- Nguồn ion hóa điện tử (EI Source)
- Interface Temp ( nhiệt độ giao diện) 280oC - Ion Source Temp (Nhiệt độ nguồn ion hóa) 200o
C
2.6.3. Thông số cột tách
- Hãng sản xuất: Supelco Lot: 28471-U
- Tên cột: SLB-5ms Nhiệt độ max: 340o C
- Thành phần chính cột: poly(5% diphenyl/95% dimethyl siloxane)
- Độ dài x Đƣờng kính cột x Bề dày lớp film: 30m x 0,25mm x 0,25μm
2.7. PHƢƠNG PHÁP KHẢO SÁT ĐÁNH GIÁ
2.7.1. Khoảng tuyến tính và đƣờng chuẩn định lƣợng của phƣơng pháp 2.7.1.1. Định tính.
Dựa vào thời gian lƣu tR của cấu tử phân tích và thời gian lƣu của chất chuẩn trong cùng điều kiện phân tích sắc ký. Tuy nhiên thời gian lƣu không đảm bảo hai chất trùng nhau hoàn toàn, để đảm bảo hơn cho việc định danh có thể so sánh thời gian lƣu của chất phân tích và chất chuẩn trên hai pha tĩnh khác nhau.
2.7.1.2. Định lƣợng.
Diện tích mũi sắc ký trên sắc ký đồ tỉ lệ với nồng độ của chất từ đó có thể tính đƣợc chính xác nồng độ của mỗi thành phần trong hỗn hợp. Chúng tôi sử dụng phƣơng pháp nội chuẩn để định lƣợng:
So sánh gián tiếp mũi sắc ký của chất phân tích theo diện tích mũi sắc ký của chất chuẩn thông qua diện tích của chất nội chuẩn từ đó suy ra nồng độ của chất phân tích trong mẫu.
Chất nội chuẩn đƣợc sử dụng cần có các tính chất:
- Có lý tính và hoá tính gần giống với chất cần phân tích.
- Không hiện diện trong thành phần mẫu.
- Có thời gian lƣu gần với các chất cần phân tích nhƣng phải tách hoàn toàn khỏi chất phân tích.
- Cƣờng độ tín hiệu đo tƣơng đƣơng với chất cần phân tích.
- Không tham gia phản ứng với chất phân tích.
Phƣơng pháp nội chuẩn có ƣu điểm là cho kết quả chính xác hơn, tránh đƣợc sai số do thể tích mẫu đƣa vào máy sắc ký không đều nhau. Tuy nhiên cần phải chọn đƣợc chất nội chuẩn phù hợp với điều kiện phân tích.
Phƣơng trình đƣờng chuẩn trong phƣơng pháp nội chuẩn:
b kC A A x IS x
Ax, AIS: diện tích của chất cần phân tích và chất nội chuẩn
Cx: nồng độ của chất cần phân tích.
2.7.2. Khảo sát giới hạn phát hi n (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) của phƣơng pháp
độ nhỏ nhất của chất phân tích mà có tín hiệu sắc ký lớn gấp 3 lần tín hiệu đƣờng nền. (LOD – xác định theo quy tắc 3 (xicma) Đây là một thông số đặc trƣng cho độ nhạy của phƣơng pháp.
LOD = tín hiệu chiều cao pic/nhi u đƣờng nền 3.
Giới hạn định lƣợng (LOQ: limit of quantitation) là nồng độ nhỏ nhất đo đƣợc của phƣơng pháp, đó là nồng độ tối thiểu của một chất trong một nền mẫu xác định mà thiết bị có thể đo đúng đƣợc với một RSD% quy định, thƣờng LOQ là nồng độ chất phân tích mà cho tín hiệu gấp 10 lần tín hiệu đƣờng nền
2.7.3. Khảo sát độ lặp lại
Độ lặp lại đƣợc dùng để đánh giá định lƣợng độ phân tán của các kết quả phân tích. Đại lƣợng này đặc trƣng cho độ gần về giá trị trung bình của hai hay nhiều phép đo nhận đƣợc trong những điều kiện giống nhau.
Đánh giá độ lặp lại dựa trên độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD) hoặc độ biến động.
2.7.4. Xác định hi u suất thu hồi
Đây là một thông số không thể thiếu đƣợc trong khi đánh giá một phƣơng pháp phân tích.
- Dựa vào việc thêm chuẩn vào mẫu thử, cùng với việc tiến hành làm mẫu thực không có thêm chuẩn
S mâu mâu SO C C %X 100 C Trong đó:
%X: hiệu xuất thu hồi
Cs+mâu: nồng độ tổng chuẩn thêm vào và mẫu thực có đo đƣợc. Cmâu: nồng độ thực đo đƣợc.
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. XÁC ĐỊNH THỨ TỰ MŨI SẮC KÝ VÀ THỜI GIAN LƢU
Tiến hành phân tích các dung dịch chuẩn gốc chlor hữu cơ có cùng nồng độ, từ đó xác định thời gian lƣu của từng chất trong hỗn hợp nghĩa là xác định đƣợc thứ tự của các chất cần phân tích trong sắc ký đồ. Điều kiện chạy máy nhƣ trình bày ở mục 2.6. Kết quả thu đƣợc ở bảng 3.1
Bảng 3.1. Thứ tự mũi sắc ký và thời gian lƣu
Dung dịch chuẩn lƣu (phút) Thời gian
Ion định lƣợng (m/z) Ion so sánh Thứ tự mũi trên sắc ký đồ lindane 17.167 181 183.00-109.00 1 heptachlor 19.408 100 272.00-274.00 2 aldrin-R 20.517 66 263.00-79.00 3 heptachlor epoxide 21.667 81 353.00-355.00 4 dieldrin 23.558 79 82.00-81.00 8 endrin 24.175 81 263.00-79.00 9
3.2. KHẢO SÁT KHOẢNG TUYẾN TÍNH VÀ XÂY DỰNG ĐƢỜNG CHUẨN XÁC ĐỊNH THUỐC TRỪ SÂU
Dùng dung dịch nội chuẩn trifluralin nồng độ là 100 ppb ( g/L). Để xác định khoảng tuyến tính của lindane, heptachlor, aldrin-R, heptachlor epoxide, dieldrin và endrin, chúng tôi tiến hành pha mẫu chuẩn lindane, heptachlor, aldrin-R, heptachlor epoxide, dieldrin và endrin với nồng độ nhƣ sau: 0.08 mg/L; 0.24 mg/L; 0.40 mg/L; 0.80 mg/L; 1.12 mg/L; 1.16 mg/L. Sử dụng các thông số đo nhƣ trình bày ở mục 2.8, phân tích các chất chuẩn nói trên để xác định phƣơng trình hồi quy tuyến tính dựa vào tỉ lệ diện tích các pic, kết quả thu đƣợc ở các bảng 3.2 đến 3.7.
Bảng 3.2: Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của lindane
STD1 STD2 STD3 STD5 STD6 STD7 Nồng độ (mg/L) 0.08 0.24 0.40 0.80 1.20 1.60 Diện tích (Sc) 559 2300 5986 11849 20436 28709 Diện tích (Snc); C = 0,1 mg/L) 22636 19827 27189 26325 30269 30887 Tỷ lệ Sc/Snc 0.025 0.116 0.220 0.450 0.675 0.929
Từ số liệu bảng 3.2 trên ta xác định đƣợc phƣơng trình đƣờng chuẩn: Y = 0.5908 x – 0.0228, với R2 = 0.9996.
Đồ thị đƣờng chuẩn của lindane nhƣ hình sau:
Nhƣ vậy trong khoảng nồng độ khảo sát (0.08 mg/L đến 1.60 mg/L) có sự quan hệ tuyến tính giữa diện tích pic sắc ký phân tích với nồng độ chất phân tích.
Bảng 3.3: Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của heptachlor
STD1 STD2 STD3 STD5 STD6 STD7 Nồng độ (mg/L) 0.08 0.24 0.40 0.80 1.20 1.60 Diện tích (Sc) 1245 4560 10298 22998 42139 62157 Diện tích (Snc); C = 0,1 mg/L) 22636 19827 27189 26325 30269 30887 Tỷ lệ Sc/Snc 0.055 0.230 0.379 0.874 1.392 2.012
Từ số liệu bảng 3.3 trên ta xác định đƣợc phƣơng trình đƣờng chuẩn: Y = 1.2786 x – 0.097, với R2 = 0.9955.
Đồ thị đƣờng chuẩn của heptachlor nhƣ hình sau:
Hình 3.3: Đồ thị đƣờng chuẩn của heptachlor
Nhƣ vậy trong khoảng nồng độ khảo sát (0.08 mg/L đến 1.60 mg/L) có sự quan hệ tuyến tính giữa diện tích pic sắc ký phân tích với nồng độ chất phân tích.
Bảng 3.4: Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của aldrin-R STD1 STD2 STD3 STD5 STD6 STD7 Nồng độ (mg/L) 0.08 0.24 0.40 0.80 1.20 1.60 Diện tích (Sc) 3321 8608 17330 34485 57126 78504 Diện tích (Snc); C = 0,1 mg/L) 22636 19827 27189 26325 30269 30887 Tỷ lệ Sc/Snc 0.147 0.434 0.637 1.310 1.887 2.542
Từ số liệu bảng 3.4 trên ta xác định đƣợc phƣơng trình đƣờng chuẩn: Y = 1.5631 x + 0.0341, với R2 = 0.9994.
Đồ thị đƣờng chuẩn của aldrin-R nhƣ hình sau:
Hình 3.4: Đồ thị đƣờng chuẩn của aldrin-R
Nhƣ vậy trong khoảng nồng độ khảo sát (0.08 mg/L đến 1.60 mg/L) có sự quan hệ tuyến tính giữa diện tích pic sắc ký phân tích với nồng độ chất phân tích.
Bảng 3.5: Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của heptachlor epoxide STD1 STD2 STD3 STD5 STD6 STD7 Nồng độ (mg/L) 0.08 0.24 0.40 0.80 1.20 1.60 Diện tích (Sc) 1763 4919 9788 20330 34228 47083 Diện tích (Snc); C = 0,1 mg/L) 22636 19827 27189 26325 30269 30887 Tỷ lệ Sc/Snc 0.078 0.248 0.360 0.772 1.131 1.524
Từ số liệu bảng 3.5 trên ta xác định đƣợc phƣơng trình đƣờng chuẩn: Y = 0.9477 x + 0.0032, với R2 = 0.9993.
Đồ thị đƣờng chuẩn của heptachlo epoxide nhƣ hình sau:
Hình 3.5: Đồ thị đƣờng chuẩn của heptachlor epoxide
Nhƣ vậy trong khoảng nồng độ khảo sát (0.08 mg/L đến 1.60 mg/L) có sự quan hệ tuyến tính giữa diện tích pic sắc ký phân tích với nồng độ chất phân tích.
Bảng 3.6: Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của dieldrin STD1 STD2 STD3 STD5 STD6 STD7 Nồng độ (mg/L) 0.24 0.72 1.20 2.40 3.60 4.80 Diện tích (Sc) 14491 38182 76746 156156 256586 350599 Diện tích (Snc); C = 0,1 mg/L) 22636 19827 27189 26325 30269 30887 Tỷ lệ Sc/Snc 0.640 1.926 2.823 5.932 8.477 11.351
Từ số liệu bảng 3.6 trên ta xác định đƣợc phƣơng trình đƣờng chuẩn: Y = 2.3371 x + 0.1433, với R2 = 0.9992.
Đồ thị đƣờng chuẩn của dieldrin nhƣ hình sau:
Hình 3.6: Đồ thị đƣờng chuẩn của dieldrin
Nhƣ vậy trong khoảng nồng độ khảo sát (0.24 mg/L đến 4.80 mg/L) có sự quan hệ tuyến tính giữa diện tích pic sắc ký phân tích với nồng độ chất phân tích.
Bảng 3.7: Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của Endrin STD1 STD2 STD3 STD5 STD6 STD7 Nồng độ (mg/L) 0.24 0.72 1.20 2.40 3.60 4.80 Diện tích (Sc) 1673 5355 12819 24420 43360 58927 Diện tích (Snc); C = 0,1 mg/L) 22636 19827 27189 26325 30269 30887 Tỷ lệ Sc/Snc 0.074 0.270 0.471 0.928 1.432 1.908
Từ số liệu bảng 3.7 trên ta xác định đƣợc phƣơng trình đƣờng chuẩn: Y = 0.4016 x - 0.0203, với R2 = 0.9998.
Đồ thị đƣờng chuẩn của dieldrin nhƣ hình sau:
Hình 3.7: Đồ thị đƣờng chuẩn của endrin
Nhƣ vậy trong khoảng nồng độ khảo sát (0.24 mg/L đến 4.80 mg/L) có sự quan hệ tuyến tính giữa diện tích pic sắc ký phân tích với nồng độ chất phân tích.
3.3. KHẢO SÁT ĐỘ LẶP LẠI CỦA PHƢƠNG PHÁP
Dùng dung dịch nội chuẩn là trifluralin 100 ppb ( g/L), nồng độ lindane: 0.8 mg/L, heptachlor: 0.8 mg/L, aldrin-R: 0.8 mg/L, heptachlor epoxide: 0.8 mg/L, dieldrin: 2.4 mg/L và endrin: 2.4 mg/L, thực hiện phép đo với điều kiện đã chọn. Kết quả thu đƣợc ở bảng 3.8 đến 3.13.
Bảng 3.8: Độ lặp lại của lindane
C5-1 C5-2 C5-3 C5-4 C5-5 C5-6 RSD Nồng độ (mg/L) 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 4.2% Diện tích (Sc) 12583 12911 14857 11242 12680 14808 Diện tích (Snc) 29750 31226 33768 27034 32472 37090 Tỷ lệ Sc/Snc 0.423 0.413 0.440 0.416 0.390 0.399
Bảng 3.9: Độ lặp lại của heptachlor
C5-1 C5-2 C5-3 C5-4 C5-5 C5-6 RSD Nồng độ (mg/L) 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 1.29% Diện tích (Sc) 27901 29619 31914 25532 29713 34703 Diện tích (Snc) 29750 31226 33768 27034 32472 37090 Tỷ lệ Sc/Snc 0.938 0.949 0.945 0.944 0.915 0.936
Bảng 3.10: Độ lặp lại của aldrin
C5-1 C5-2 C5-3 C5-4 C5-5 C5-6 RSD Nồng độ (mg/L) 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 1.71% Diện tích (Sc) 34431 36630 39527 31748 39412 44320 Diện tích (Snc) 29750 31226 33768 27034 32472 37090 Tỷ lệ Sc/Snc 1.157 1.173 1.171 1.174 1.214 1.195
Bảng 3.11: Độ lặp lại của heptachlor epoxide C5-1 C5-2 C5-3 C5-4 C5-5 C5-6 RSD Nồng độ (mg/L) 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 1.63% Diện tích (Sc) 21839 22285 24582 20056 23814 27752 Diện tích (Snc) 29750 31226 33768 27034 32472 37090 Tỷ lệ Sc/Snc 0.734 0.714 0.728 0.742 0.733 0.748
Bảng 3.12: Độ lặp lại của dieldrin
C5-1 C5-2 C5-3 C5-4 C5-5 C5-6 RSD Nồng độ (mg/L) 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4 1.87% Diện tích (Sc) 172730 180073 195410 155831 184739 204621 Diện tích (Snc) 29750 31226 33768 27034 32472 37090 Tỷ lệ Sc/Snc 5.806 5.767 5.787 5.764 5.689 5.517
Bảng 3.13: Độ lặp lại của endrin
C5-1 C5-2 C5-3 C5-4 C5-5 C5-6 RSD Nồng độ (mg/L) 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4 1.96% Diện tích (Sc) 30385 32265 33947 28682 33495 37421 Diện tích (Snc) 29750 31226 33768 27034 32472 37090 Tỷ lệ Sc/Snc 1.021 1.033 1.005 1.061 1.032 1.009
Nhƣ vậy: Độ lệch chuẩn tƣơng đối của chất phân tích dao động từ 1.29% đến 4.2% cho thấy phép đo đạt yêu cầu phân tích (≤ 5%).
3.4. XÁC ĐỊNH GIỚI HẠN PHÁT HIỆN VÀ GIỚI HẠN ĐỊNH LƢỢNG CỦA PHƢƠNG PHÁP
3.4.1. Giới hạn phát hi n (LOD)