4. Nội dung nghiên cứu
1.2.2.Phƣơng pháp cực phổ
Trong phƣơng pháp này, ngƣời ta phân cực điện cực giọt thủy ngân bằng một điện áp một chiều biến thiên tuyến tính với thời gian để nghiên cứu các quá trình khử cực của chất phân tích trên điện cực đó.Thiết bị cực phổ gồm hai phần chính là máy cực phổ và hệ điện cực bao gồm điện cực giọt thuỷ ngân và điện cực so sánh. Đƣờng cực phổ biểu di n sự phụ thuộc của chiều cao cƣờng độ dòng với nồng độ chất phân tích. Để xác định các lƣợng nhỏ chất thƣờng dùng cực phổ cổ điển (10-3
– n.10-5). Để xác định các lƣợng chất cực nhỏ thƣờng dùng các phƣơng pháp cực phổ hiện đại nhƣ cực phổ sóng vuông, cực phổ xung vi phân [7].
Phƣơng pháp xác định dƣ lƣợng thuốc bảo vệ thực vật Diazinon (DI) bằng kỹ thuật stripping sóng vuông hấp phụ quét nhanh trên cực giọt rơi đã đƣợc mô tả bởi Đinh Thị Nhƣ Hiền và các cộng sự [4]. Diazinon hấp phụ ở điện cực thủy ngân giọt rơi, sóng phổ thu đƣợc ở giá trị điện thế -1012 mV so với điện cực Ag/AgCl/KCl trong dung dịch nền amoni acetat 0,4N pH 4,3. Cƣờng độ dòng điện tƣơng ứng với sóng phổ thu đƣợc đạt tuyến tính trong khoảng nồng độ 800 – 3200 ppb. Giới hạn phát hiện là 16,49 ppb. Ảnh hƣởng của một số loại thuốc trừ sâu khác thƣờng đƣợc dùng cùng với DI cũng đƣợc nghiên cứu. Phƣơng pháp này đã đƣợc sử dụng để phân tích dƣ lƣợng DI
trong lá artichoke tƣơi. Độ thu hồi của Diazinon từ lá artichoke tƣơi nằm trong khoảng 90,31 – 93,55%. Giới hạn phát hiện trên nền dịch chiết lá artichoke đạt 29,82 ppb. Phƣơng pháp có độ lặp lại và tính chọn lọc cao.
A. Guiberteau và cộng sự [30] đã xác định carbaryl và carbofuran trong các mẫu nƣớc sông bằng phƣơng pháp cực phổ xung vi phân. Mẫu nƣớc sau khi xử lí sẽ đƣợc xác định bằng phƣơng pháp cực phổ xung vi phân với các điều kiện sau: tốc độ quét 20mV/s (bƣớc nhảy thế: 5mV, khoảng thời gian 0,25s), biên độ xung 50 mV trong khoảng từ +0,4V đến +0,8V. Khoảng tuyến tính của carbaryl từ 5.10-7
- 10-4M và của carbofuran từ 5.10-7
– 5.10-5M với độ lệch chuẩn tƣơng đối tƣơng ứng là 1,62 và 1,86%.
1.2.3. Phƣơng pháp đi n di mao quản
Điện di mao quản (Capillary Electropherosis-CE) là phƣơng pháp phân tách các chất dựa vào sự khác nhau về tốc độ chuyển động của chúng dƣới tác dụng của lực điện trƣờng trong một mao quản h p. Đây là một kĩ thuật mới đƣợc phát triển, có thời gian phân tích nhanh, tốn ít dung môi và hóa chất. Việc xác định các hóa chất bảo vệ thực vật bằng thiết bị này vẫn đang đƣợc nghiên cứu và cũng chƣa có nhiều loại thuốc trừ sâu đƣợc xác định bằng phƣơng pháp này.
Ling Wang và cộng sự [71] đã tách và xác định dƣ lƣợng thuốc trừ sâu carbamat bằng phƣơng pháp điện di mao quản đẳng áp. Cột mao quản có đƣờng kính 75 m đƣợc nhồi hạt ODS 3 m. Pha động bao gồm 30% acetonitril và 70% dung dịch đệm CH3COONH4 5mM (pH=6,5) chứa 1mM SDS và 0,01% trietylamine (TEA). Tại các điều kiện tối ƣu, 10 carbamat đã đƣợc tách nhanh trong vòng 20 phút. Các mẫu rau đƣợc làm sạch qua SPE. Phƣơng pháp có giới hạn phát hiện từ 0,05 – 1,6 mg/kg và hiệu suất thu hồi từ 51,3 – 109,2% với độ lệch chuẩn RSD < 11,4%. Phƣơng pháp đã đƣợc áp dụng để xác định 10 loại carbamat trong một số loại rau.
Mian Liu và cộng sự đã xác định dƣ lƣợng fenoxycarb trong lúa mì bằng phƣơng pháp điện di mao quản khô và phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [50]. Các mẫu bột mì đƣợc chiết với aceton sau đó làm sạch bằng phƣơng pháp chiết lỏng - lỏng với diclometan. Phƣơng pháp HPLC sử dụng detector UV tại bƣớc sóng = 199 nm, cột C18 và pha động là MeOH : H2O = 6:4 (theo thể tích). Phƣơng pháp điện di sử dụng mao quản đƣờng kính 50 m x 48,5 cm x 48 cm chiều dài hiệu dụng, thế giữa hai đầu là 30 kV, dung dịch đêm CH3COONH4 20mM (pH=9) trong 95% MeOH. Cả hai phƣơng pháp đều có giới hạn phát hiện thấp 0,008 mg/kg đối với HPLC và 0,024 mg/kg đối với điện di mao quản khô và hiệu suất thu hồi cao trên 85%.
Phƣơng pháp sắc ký mao quản điện động học mixen đã xác định đồng thời aldicarb, carbofuran và một số dạng chuyển hóa của nó trong nƣớc bề mặt. Mẫu sau khi làm sạch qua cột chiết pha rắn có chứa 500mg than hoạt tính đƣợc tách bằng hệ thống sắc ký mao quản điện động học mixen sử dụng cột mao quản có đƣờng kính 75 m, chiều dài hiệu dụng của cột 50 cm. Các chất đƣợc tách trong môi trƣờng đệm natri borat/acid clohidric (20 mM, pH=8) và sử dụng natri dodecyl sunfat 140 mM làm chất hoạt động bề mặt để tạo ra các mixen. Các điều kiện chạy máy: điện thế tách 23 kV, thời gian bơm mẫu 12 giây, nhiệt độ cột tách 25C và detector UV tại bƣớc sóng 210 nm. Phƣơng pháp có giới hạn phát hiện từ 2 – 7,4 g/L, độ thu hồi cao từ 77 – 97% với độ lệch chuẩn tƣơng đối 2 – 7% [20].
1.2.4. Phƣơng pháp mi n dịch h a học ELISA
ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu cần phân tích. Hiện nay ELISA đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu nhƣ y học. nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lƣợng các sản phẩm thực phẩm.
Kĩ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/mL). So với kĩ thuật mi n dịch phóng xạ (RIA- Radio Immuno Assay) thì kĩ thuật này rẻ tiền và an toàn hơn mà vẫn đảm bảo độ chính xác nhƣ nhau. ELISA đƣợc dùng để xác định nhiều tác nhân gây bệnh nhƣ virus, vi khuẩn, nấm, kí sinh. Đây cũng là một phƣơng pháp sàng lọc rất tốt để phát hiện dƣ lƣợng của từng loại thuốc trừ sâu trong các mẫu thực phẩm và môi trƣờng.
Phƣơng pháp ELISA cạnh tranh trực tiếp đã đƣợc phát triển để phát hiện thuốc trừ sâu phốt pho hữu cơ (OP) trong các mẫu nƣớc. Diethyl (carboxymethyl) phosphonate đƣợc sử dụng nhƣ là hapten kết hợp với huyết thanh albumin bovin (BSA) để tạo ra các kháng thể đa dòng PcAbs [68]. Các kháng thể đa dòng có ái lực và độ đặc hiệu cao với parathion, dichlorvos và pirimiphos. Phƣơng pháp có độ nhạy IC50 đối với parathion, pirimiphos và dichlorvos lần lƣợt là 0.428 g/mL, 0,331 g/mL và 1,25 g/mL với giới hạn phát hiện tƣơng ứng là 0,0125 g/mL, 0,0116 g/mL và 0.048 g/mL. Hiệu suất thu hồi của parathion, pirimiphos và dichlorvos trong mẫu nƣớc dao động từ 90% đến 160%. Kết quả cho thấy các phƣơng pháp ELISA có thể là một công cụ phân tích thuận tiện để kiểm soát dƣ lƣợng thuốc trừ sâu trong nƣớc.
Một phƣơng pháp ELISA cạnh tranh cũng đƣợc phát triển để phân tích thuốc trừ sâu imidacloprid trong các mẫu nông sản và môi trƣờng với độ nhạy IC50 là 17,3 ng/mL [44].
Các phƣơng pháp ELISA hiện nay đã đƣợc ứng dụng rất rộng rãi trên thị trƣờng bằng các Kit thử để phát hiện nhanh dƣ lƣợng thuốc trừ sâu trong thực phẩm và môi trƣờng.
1.2.5. Phƣơng pháp cảm biến sinh học
Một trong những phƣơng pháp mới đƣợc sử dụng để phân tích thuốc trừ sâu trong những năm gần đây là phƣơng pháp cảm biến sinh học điện hóa
sử dụng đầu thu enzyme [52]. Cơ chế hoạt động của cảm biến dựa trên phƣơng pháp ức chế enzyme để phát hiện sự hiện diện của các thuốc trừ sâu.
Acetylcholinesterase (AchE) là một enzyme quan trọng hiện diện trong hệ thần kinh của các sinh vật sống. Hoạt động xúc tác của nó bị ức chế mạnh bởi một lƣợng nhỏ thuốc trừ sâu phốt pho hữu cơ có trong môi trƣờng. Trong những năm gần đây việc sử dụng cảm biến sinh học AchE dựa trên các vật liệu nano đã rất thành công trong giám sát dƣ lƣợng thuốc trừ sâu photpho hữu cơ trong môi trƣờng. Enzyme AchE đƣợc cố định vào các vật liệu nano nhƣ nano carbon đa lớp, nano vàng, nano kẽm, CdS... Các vật liệu nano này làm tăng đáng kể khả năng xác định thuốc trừ sâu trong diện rộng [55], [57], [58], [65], [67].
Một kỹ thật dòng chảy với cảm biến sinh học enzyme khác cũng đƣợc sử dụng để phân tích thuốc trừ sâu phospho hữu cơ trong các dƣợc phẩm thần kinh. Enzyme organophosphorus-hydrolase đƣợc gắn trên điện cực phẳng vàng nhờ phƣơng pháp liên kết ngang với glutaraldehyde. Phƣơng pháp cho kết quả phân tích nhanh với độ nhạy và độ chọn lọc cao. Khoảng nồng độ tuyến tính của paraoxon và methyl parathion theo cƣờng độ dòng là 1-10 mcM [70].
1.2.6. Các phƣơng pháp sắc ký
Phƣơng pháp sắc ký là một trong những phƣơng pháp phân tích đƣợc ứng dụng rộng rãi nhất hiện nay nhờ độ nhạy và khả năng định lƣợng tốt, phù hợp để xác định nhiều đối tƣợng khác nhau nhƣ các chất khó hoặc d bay hơi, chất phân cực hoặc kém phân cực,... Đây là kỹ thuật phân tích có ứng dụng rộng rãi cho phân tích dƣ lƣợng thuốc bảo vệ thực vật trong thực phẩm và môi trƣờng nhƣ sắc ký khí, sắc ký lỏng sử dụng các đầu dò kết hợp khác nhau nhƣ đầu dò UV, DAD, hu nh quang, đầu dò bắt điện tử v.v...
Ngày nay, phƣơng pháp HPLC đƣợc ứng dụng rất rộng rãi trong lĩnh vực phân tích định tính cũng nhƣ định lƣợng các thành phần trong dƣợc phẩm, thực phẩm, môi trƣờng, hóa chất,
Tác giả Elvira Grou và cộng sự đã xác định thuốc bảo vệ thực vật carbamat trong đất và nƣớc bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng detector UV ở bƣớc sóng 254 nm [22]. Các mẫu nƣớc đƣợc chiết lỏng lỏng với diclometan, các mẫu đất đƣợc làm sạch bằng cột florisil. Dịch chiết đƣợc đem cô quay đến cạn, hòa cặn bằng 1ml metanol và đem đo. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp đối với mẫu nƣớc từ 0,005 – 0,01 g/g, đối với mẫu đất từ 0,05–0,1 µg/g.
Tác giả Feng Tang và cộng sự [23] đã xác định dƣ lƣợng thuốc trừ sâu nhóm carbamat trong rau bằng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPLC tại 2 bƣớc sóng λ = 243 nm và λ = 207 nm. Phƣơng pháp có hiệu suất thu hồi từ 70,13 – 103,7% tại nồng độ 1 – 5 mg/kg.
Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng detetor hu nh quang xác định đồng thời các chất carbamat nhƣ aldicarb, propoxur, carbofuran, carbaryl và methiocarb trong mật cũng đã đƣợc công bố [43]. Mẫu đƣợc chiết bằng methanol và cho qua cột florisil để làm sạch. Sử dụng dung môi diclometan:hexan = 1:1 rửa giải các chất carbamat ra khỏi cột. Dịch rửa giải đem cô quay ở 40°C đến cạn và hòa cặn bằng 1ml acetonitril. Các chất carbamat đƣợc tách và xác định đồng thời bằng hệ thống sắc ký lỏng với detector hu nh quang ghép nối với tiền cột. Phƣơng pháp có giới hạn phát hiện thấp từ 4 – 5 ng/g và độ thu hồi tƣơng đối cao từ 72,02 – 92,02% ứng với nồng độ từ 50 – 200 ng/g
Tác giả Huertas-Pérez J. F. và cộng sự đã phát triển phƣơng pháp mới để xác định carbaryl trong thực phẩm thực vật và nƣớc tự nhiên bằng kĩ thuật phân tích dòng chảy [35]. Đối với mẫu nƣớc, lọc qua màng lọc 0,45 m rồi tiến hành phân tích. Đối với mẫu quả, tiến hành chiết mẫu bằng etylacetat
và làm sạch qua các loại cột chiết pha rắn nhƣ nhôm oxit, SAX, C18, silica. Hiệu suất chiết tốt nhất khi sử dụng cột nhôm oxit. Carbayl chỉ phát hu nh quang khi có của chất oxi hóa KMnO4 trong môi trƣờng kiềm nh . Hệ thống phân tích dòng chảy để xác định carbaryl gồm 3 kênh chứa 3 dung dịch khác nhau: NaOH, luminol và KMnO4. Tại các điều kiện tối ƣu, khoảng tuyến tính carbaryl từ 5 – 100 ng/mL và giới hạn phát hiện là 4,9 ng/mL. Đây là một phƣơng pháp đơn giản, nhanh và d dàng kết hợp với phƣơng pháp sắc ký lỏng để xác định đồng thời một số carbamat.
Quy trình xác định 10 hợp chất thuốc trừ sâu thông dụng họ carbamate: Aldicard Sulfoxide, Aldicarb sulfone, Oxamyl, Methomyl, 3- Hydroxycarbofuran, Aldicarb, Propoxur, Carbofuran, Carbaryl và Methiocarb trong nƣớc, rau và gừng đã đƣợc xây dựng dựa trên phƣơng pháp tách bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, phát hiện bằng đầu dò hu nh quang sau khi đã tạo dẫn xuất sau cột [6]. Mẫu rắn đƣợc nghiền mịn trong methanol (MeOH), sau đó lọc. Dịch trích hay mẫu nƣớc đƣợc làm sạch bằng chiết lỏng - lỏng/SPE silicagel hay bằng SPE C18. Các carbamate đƣợc tách qua cột HPLC C18 với pha động là MeOH/nƣớc theo chế độ gradient nồng độ và đƣợc tạo dẫn xuất với O – phthalaldehyde (OPA) và 2 – mercaptoethanol. Hợp chất hu nh quang 1 – hydroxytylthio – 2 – metylisoindol tạo thành đƣợc phát hiện bằng đầu dò hu nh quang với λ kích thích ở 340 nm và λ phát xạ ờ 445 nm. Giới hạn phát hiện cho các carbamate trong khoảng từ 0.5 - 5.0 ppb, giới hạn định lƣợng từ 1.69 – 9.09 ppb và hiệu suất thu hồi từ 73 - 95%. Nồng độ carbamate trong một số mẫu rau, mẫu gừng và mẫu nƣớc tại một sốvị trí khảo sát thu đƣợc khá nhỏ.
S.A. Baig và các cộng sự [59] đã xác định dƣ lƣợng thuốc trừ sâu họ lân hữu cơ nhƣ Triazophos, profenofos and chlorpyrifos trong một số loại thực phẩm nhƣ bí ngô, đậu bắp, cà tím ở phía nam Pakistan bằng phƣơng pháp HPLC đầu dò UV. Các mẫu sau nghiền nhỏ đƣợc chiết bằng hỗn hợp
Na2SO4 khan, NaCl và etyl axetat. Dịch lọc thu đƣợc cho vào cột chứa Na2SO4 khan để loại nƣớc và than hoạt tính để tẩy màu. Sau khi cô quay ở 550C cho đến thể tích 10ml, dịch lọc đem làm khô dƣới dòng khí nitơ và hòa tan trong dung môi pha động acetonitrile (ACN). Các thuốc trừ sâu đƣợc tách qua cột HPLC đầu dò UV ở bƣớc sóng 208 nm sử dụng cột Supelco C18 với pha động ACN. Hiệu suất thu hồi đạt trên 85% với giới hạn phát hiện 0,5mg/kg. Các kết quả phân tích cho thấy trong 108 mẫu rau quả đƣợc lấy từ vùng đất nghiên cứu, hơn 33% mẫu có chứa 3 loại thuốc trừ sâu này, trong đó 8% có dƣ lƣợng vƣợt ngƣỡng cho phép.
Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ là một kĩ thuật mới đƣợc phát triển trong những năm gần đây. Về cơ bản, nó là phƣơng pháp sắc ký lỏng sử dụng bộ phận phát hiện là detector khối phổ. Phƣơng pháp này tuy mới ra đời nhƣng nó đƣợc ứng dụng rộng rãi để phân tích đồng thời các thuốc trừ sâu đặc biệt là nhóm carbamat. Phƣơng pháp có thể phân tích đồng thời từ hàng chục đến hàng trăm các loại thuốc trừ sâu khác nhau. Phƣơng pháp có nhiều ƣu điểm nhƣ độ chọn lọc cao, giới hạn phát hiện thấp, thời gian phân tích nhanh, có thể định lƣợng đồng thời các chất có thời gian lƣu giống nhau mà phƣơng pháp sắc kí lỏng thƣờng không làm đƣợc.
Gianni Sagratini và cộng sự đã xác định dƣ lƣợng thuốc trừ sâu carbamat và phenylure trong một số loại quả bằng phƣơng pháp vi chiết pha rắn và sắc ký lỏng khối phổ [26]. Điều kiện chiết mẫu tối ƣu ở nhiệt độ 20C, thời gian hấp phụ mẫu là 90 phút và thể tích mẫu 1ml. Các sợi silica đƣợc phủ 3 loại chất hấp phụ: cacbowax 50 µm, polydimetylsiloxan/divinylbenzen (PDMS/DVB) 60 m và polyacrylat 85 m. Giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp từ 0,005 – 0,05 g/mL, tùy thuộc từng chất. Phƣơng pháp đã đƣợc ứng dụng để xác định thuốc trừ sâu trong các mẫu quả. Dƣ lƣợng thuốc bảo vệ thực vật nhóm carbamat và lân hữu cơ trong rau quả cũng đã đƣợc xác định đồng thời bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ bởi Min Liu và các cộng
sự [51]. Sau khi chiết bằng ACN, mẫu đƣợc tách bằng cách chiết pha rắn với chất hấp phụ là primary secondary amine. Hiệu suất thu hồi đạt từ 70 – 110% với RSD < 8%. Giới hạn phát hiện của các chất từ 0,5 – 10 ng/mL. Phƣơng