4. Nội dung nghiên cứu
1.2.6.Các phƣơng pháp sắc ký
Phƣơng pháp sắc ký là một trong những phƣơng pháp phân tích đƣợc ứng dụng rộng rãi nhất hiện nay nhờ độ nhạy và khả năng định lƣợng tốt, phù hợp để xác định nhiều đối tƣợng khác nhau nhƣ các chất khó hoặc d bay hơi, chất phân cực hoặc kém phân cực,... Đây là kỹ thuật phân tích có ứng dụng rộng rãi cho phân tích dƣ lƣợng thuốc bảo vệ thực vật trong thực phẩm và môi trƣờng nhƣ sắc ký khí, sắc ký lỏng sử dụng các đầu dò kết hợp khác nhau nhƣ đầu dò UV, DAD, hu nh quang, đầu dò bắt điện tử v.v...
Ngày nay, phƣơng pháp HPLC đƣợc ứng dụng rất rộng rãi trong lĩnh vực phân tích định tính cũng nhƣ định lƣợng các thành phần trong dƣợc phẩm, thực phẩm, môi trƣờng, hóa chất,
Tác giả Elvira Grou và cộng sự đã xác định thuốc bảo vệ thực vật carbamat trong đất và nƣớc bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng detector UV ở bƣớc sóng 254 nm [22]. Các mẫu nƣớc đƣợc chiết lỏng lỏng với diclometan, các mẫu đất đƣợc làm sạch bằng cột florisil. Dịch chiết đƣợc đem cô quay đến cạn, hòa cặn bằng 1ml metanol và đem đo. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp đối với mẫu nƣớc từ 0,005 – 0,01 g/g, đối với mẫu đất từ 0,05–0,1 µg/g.
Tác giả Feng Tang và cộng sự [23] đã xác định dƣ lƣợng thuốc trừ sâu nhóm carbamat trong rau bằng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPLC tại 2 bƣớc sóng λ = 243 nm và λ = 207 nm. Phƣơng pháp có hiệu suất thu hồi từ 70,13 – 103,7% tại nồng độ 1 – 5 mg/kg.
Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng detetor hu nh quang xác định đồng thời các chất carbamat nhƣ aldicarb, propoxur, carbofuran, carbaryl và methiocarb trong mật cũng đã đƣợc công bố [43]. Mẫu đƣợc chiết bằng methanol và cho qua cột florisil để làm sạch. Sử dụng dung môi diclometan:hexan = 1:1 rửa giải các chất carbamat ra khỏi cột. Dịch rửa giải đem cô quay ở 40°C đến cạn và hòa cặn bằng 1ml acetonitril. Các chất carbamat đƣợc tách và xác định đồng thời bằng hệ thống sắc ký lỏng với detector hu nh quang ghép nối với tiền cột. Phƣơng pháp có giới hạn phát hiện thấp từ 4 – 5 ng/g và độ thu hồi tƣơng đối cao từ 72,02 – 92,02% ứng với nồng độ từ 50 – 200 ng/g
Tác giả Huertas-Pérez J. F. và cộng sự đã phát triển phƣơng pháp mới để xác định carbaryl trong thực phẩm thực vật và nƣớc tự nhiên bằng kĩ thuật phân tích dòng chảy [35]. Đối với mẫu nƣớc, lọc qua màng lọc 0,45 m rồi tiến hành phân tích. Đối với mẫu quả, tiến hành chiết mẫu bằng etylacetat
và làm sạch qua các loại cột chiết pha rắn nhƣ nhôm oxit, SAX, C18, silica. Hiệu suất chiết tốt nhất khi sử dụng cột nhôm oxit. Carbayl chỉ phát hu nh quang khi có của chất oxi hóa KMnO4 trong môi trƣờng kiềm nh . Hệ thống phân tích dòng chảy để xác định carbaryl gồm 3 kênh chứa 3 dung dịch khác nhau: NaOH, luminol và KMnO4. Tại các điều kiện tối ƣu, khoảng tuyến tính carbaryl từ 5 – 100 ng/mL và giới hạn phát hiện là 4,9 ng/mL. Đây là một phƣơng pháp đơn giản, nhanh và d dàng kết hợp với phƣơng pháp sắc ký lỏng để xác định đồng thời một số carbamat.
Quy trình xác định 10 hợp chất thuốc trừ sâu thông dụng họ carbamate: Aldicard Sulfoxide, Aldicarb sulfone, Oxamyl, Methomyl, 3- Hydroxycarbofuran, Aldicarb, Propoxur, Carbofuran, Carbaryl và Methiocarb trong nƣớc, rau và gừng đã đƣợc xây dựng dựa trên phƣơng pháp tách bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, phát hiện bằng đầu dò hu nh quang sau khi đã tạo dẫn xuất sau cột [6]. Mẫu rắn đƣợc nghiền mịn trong methanol (MeOH), sau đó lọc. Dịch trích hay mẫu nƣớc đƣợc làm sạch bằng chiết lỏng - lỏng/SPE silicagel hay bằng SPE C18. Các carbamate đƣợc tách qua cột HPLC C18 với pha động là MeOH/nƣớc theo chế độ gradient nồng độ và đƣợc tạo dẫn xuất với O – phthalaldehyde (OPA) và 2 – mercaptoethanol. Hợp chất hu nh quang 1 – hydroxytylthio – 2 – metylisoindol tạo thành đƣợc phát hiện bằng đầu dò hu nh quang với λ kích thích ở 340 nm và λ phát xạ ờ 445 nm. Giới hạn phát hiện cho các carbamate trong khoảng từ 0.5 - 5.0 ppb, giới hạn định lƣợng từ 1.69 – 9.09 ppb và hiệu suất thu hồi từ 73 - 95%. Nồng độ carbamate trong một số mẫu rau, mẫu gừng và mẫu nƣớc tại một sốvị trí khảo sát thu đƣợc khá nhỏ.
S.A. Baig và các cộng sự [59] đã xác định dƣ lƣợng thuốc trừ sâu họ lân hữu cơ nhƣ Triazophos, profenofos and chlorpyrifos trong một số loại thực phẩm nhƣ bí ngô, đậu bắp, cà tím ở phía nam Pakistan bằng phƣơng pháp HPLC đầu dò UV. Các mẫu sau nghiền nhỏ đƣợc chiết bằng hỗn hợp
Na2SO4 khan, NaCl và etyl axetat. Dịch lọc thu đƣợc cho vào cột chứa Na2SO4 khan để loại nƣớc và than hoạt tính để tẩy màu. Sau khi cô quay ở 550C cho đến thể tích 10ml, dịch lọc đem làm khô dƣới dòng khí nitơ và hòa tan trong dung môi pha động acetonitrile (ACN). Các thuốc trừ sâu đƣợc tách qua cột HPLC đầu dò UV ở bƣớc sóng 208 nm sử dụng cột Supelco C18 với pha động ACN. Hiệu suất thu hồi đạt trên 85% với giới hạn phát hiện 0,5mg/kg. Các kết quả phân tích cho thấy trong 108 mẫu rau quả đƣợc lấy từ vùng đất nghiên cứu, hơn 33% mẫu có chứa 3 loại thuốc trừ sâu này, trong đó 8% có dƣ lƣợng vƣợt ngƣỡng cho phép.
Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ là một kĩ thuật mới đƣợc phát triển trong những năm gần đây. Về cơ bản, nó là phƣơng pháp sắc ký lỏng sử dụng bộ phận phát hiện là detector khối phổ. Phƣơng pháp này tuy mới ra đời nhƣng nó đƣợc ứng dụng rộng rãi để phân tích đồng thời các thuốc trừ sâu đặc biệt là nhóm carbamat. Phƣơng pháp có thể phân tích đồng thời từ hàng chục đến hàng trăm các loại thuốc trừ sâu khác nhau. Phƣơng pháp có nhiều ƣu điểm nhƣ độ chọn lọc cao, giới hạn phát hiện thấp, thời gian phân tích nhanh, có thể định lƣợng đồng thời các chất có thời gian lƣu giống nhau mà phƣơng pháp sắc kí lỏng thƣờng không làm đƣợc.
Gianni Sagratini và cộng sự đã xác định dƣ lƣợng thuốc trừ sâu carbamat và phenylure trong một số loại quả bằng phƣơng pháp vi chiết pha rắn và sắc ký lỏng khối phổ [26]. Điều kiện chiết mẫu tối ƣu ở nhiệt độ 20C, thời gian hấp phụ mẫu là 90 phút và thể tích mẫu 1ml. Các sợi silica đƣợc phủ 3 loại chất hấp phụ: cacbowax 50 µm, polydimetylsiloxan/divinylbenzen (PDMS/DVB) 60 m và polyacrylat 85 m. Giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp từ 0,005 – 0,05 g/mL, tùy thuộc từng chất. Phƣơng pháp đã đƣợc ứng dụng để xác định thuốc trừ sâu trong các mẫu quả. Dƣ lƣợng thuốc bảo vệ thực vật nhóm carbamat và lân hữu cơ trong rau quả cũng đã đƣợc xác định đồng thời bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ bởi Min Liu và các cộng
sự [51]. Sau khi chiết bằng ACN, mẫu đƣợc tách bằng cách chiết pha rắn với chất hấp phụ là primary secondary amine. Hiệu suất thu hồi đạt từ 70 – 110% với RSD < 8%. Giới hạn phát hiện của các chất từ 0,5 – 10 ng/mL. Phƣơng pháp đã đƣợc ứng dụng để xác định thuốc trừ sâu trong rau quả. Trong 25 mẫu rau quả đƣợc lấy từ các chợ, gần 70% mẫu chứa một hoặc vài loại thuốc trừ sâu, trên 30% mẫu còn lại chứa nhiều loại thuốc trừ sâu. Tuy nhiên, tất cả các nồng độ thuốc trừ sâu tìm thấy đếu thấp hơn giới hạn cho phép.
Dƣ lƣợng carbamat trong rau quả tại các chợ ở Valencian đã đƣợc xác định bằng phƣơng pháp khuếch tán trên nền pha rắn và sắc ký lỏng khối phổ [24]. Mẫu đƣợc chiết trên nền các pha rắn khác nhau: C8, C18, NH2, CN và phenyl. Hiệu suất chiết tốt nhất trên nền pha rắn C8 đạt từ 64 – 106% với RSD 5 – 15%. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp từ 0,001 – 0,01 mg/kg, thấp hơn giới hạn cho phép của châu u từ 10 – 100 lần. Phƣơng pháp đƣợc ứng dụng để xác định carbamat trong các mẫu rau quả tại các chợ ở Valencian.
Dƣ lƣợng thuốc trừ sâu 2,4-D, carbofuran, clomazone và tebuconazole trong mẫu nƣớc ngầm trong vùng đất nông nghiệp phía nam Brazil đƣợc xác định bằng phƣơng pháp HPLC đầu dò DAD và HPLC ion hóa tia điện ESI với đầu dò hai lần khối phổ MS/MS. Mẫu phân tích đƣợc trích ly trên pha rắn với cột C18. Giới hạn định lƣợng là 0,2 mg/L đối với các thuốc trừ sâu bằng HPLC-UV và 4,0 ng/L đối với 2,4D bằng HPLC-ESI-MS/MS. Hàm lƣợng các thuốc trừ sâu đã đƣợc tìm thấy trong mẫu nƣớc ngầm với các nồng độ khác nhau từ 0,25 - 10,40 mg/L với carbofuran, 0,20 - 0,82 mg/L đối với clomazone và 0,20 - 4,16 mg/L đới với tebuconazole [66].
1.2.6.2. Phƣơng pháp sắc ký khí
Phƣơng pháp sắc ký khí đã đƣợc ứng dụng rộng rãi để xác định các hóa chất bảo vệ thực vật nhƣ các chất clo hữu cơ, lân hữu cơ, pyrethroid và
carbamat. Phƣơng pháp có thể phân tích những chất d bay hơi cũng nhƣ các chất khó bay hơi (tạo dẫn xuất trƣớc và sau cột).
Xác định ethylcarbamat trong đồ uống bằng phƣơng pháp sắc ký khí với detector bắt điện tử và sắc ký khí khối phổ đã đƣợc xây dựng bởi
Conacher H.B và các cộng sự [18]. Các mẫu đƣợc pha loãng bằng ethanol 10% rồi đƣợc chiết bằng diclometan. Dịch chiết đƣợc đem cô đến gần cạn và đem đo. Phƣơng pháp này đã đƣợc đánh giá ở 5 phòng thí nghiệm với 4 phòng sử dụng detector ECD và 1 phòng sử dụng detector MS. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp thấp, khoảng 5 g/kg đối với detector ECD và 0,5 g/kg đối với detector MS.
Phƣơng pháp xác định đồng thời 29 loại thuốc trừ sâu carbamat và nhóm nitơ hữu cơ trong thực phẩm bằng phƣơng pháp sắc ký khí khối phổ cũng đã đƣợc công bố [41]. Mẫu đƣợc chiết bằng aceton và đƣợc làm sạch bằng 3 loại cột chiết pha rắn khác nhau: cột diatomaceous, cột diatomit kết hợp với cột C18, cột florisil. Hiệu suất chiết các mẫu thực phẩm bằng 3 loại cột đều trên 80%. Sau đó, mẫu đƣợc xác định bằng phƣơng pháp sắc ký khí khối phổ. Chƣơng trình chạy khối phổ đƣợc chia làm 7 cửa sổ thời gian lƣu và mỗi cửa sổ có từ 10 – 15 mảnh ion con. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp thấp từ 0,01 – 0,1µg/mL.
Tác giả Hu X. và các cộng sự đã xác định dƣ lƣợng thuốc trừ sâu trong nƣớc táo bằng phƣơng pháp sắc ký khí khối phổ [72]. Mẫu nƣớc táo đƣợc chiết bằng phƣơng pháp khuếch tán trên nền pha rắn diatomaceous (tảo cát) và rửa giải bằng dung môi hexan:diclometan = 1:1 tốc độ 5ml/phút. Phƣơng pháp có độ thu hồi 70 – 110% và hệ số biến thiên từ 1,62 – 18,3% với khoảng nồng độ 0,01 – 0,2 mg/kg.
Dƣ lƣợng các thuốc trừ sâu họ clo hữu cơ, lân hữu cơ và pyrethroid trong các loại nông sản gồm bột ngũ cốc, trái đào và rau diếp đƣợc xác định bằng phép phân tích GC-ECD, GC-MS bởi A. Balinova và các cộng sự [13].
Mẫu đƣợc chiết với dung môi acetone:nƣớc (8:2) sau đó đƣợc lọc lấy dịch chiết. Dịch chiết đƣợc pha loãng theo tỉ lệ 5g mẫu/200ml nƣớc rồi cho qua cột GCB (400mg ENVI-Carb); rửa với ethyl acetate: methanol (8:2). Tiếp tục cho qua cột SAX/PSA (250mg + 250mg); rửa giải bằng ethyl acetate:methanol (8:2). Sau đó cho bay hơi dịch chiết còn 5ml và lấy dịch này tiêm vào máy sắc ký. Giới hạn phát hiện LOD của phƣơng pháp từ 0.0005 - 0.004 mg/kg và giới hạn định lƣợng LOQ từ 0.005 - 0.01 mg/kg.
Tác giả Sandra R. R và cộng sự đã phân tích dƣ lƣợng thuốc trừ sâu nhóm clo hữu cơ, photphos hữu cơ, họ cúc và các hợp chất chứa nitơ trong mật ong bằng phƣơng pháp sắc ký khí ghép khối phổ [61]. Mẫu mật ong đƣợc đồng hoá trong nƣớc rồi chiết lỏng - lỏng với các dung môi acetonitrile, acetone, etyl acetate và dichloromethane. Dịch chiết hữu cơ thu đƣợc đem đi cô quay rồi hoà tan lại trong etyl acetate và lọc qua giấy lọc PTFE 0.5 m. Dịch qua lọc đƣợc cho qua cột SPE (Florisil) và rửa giải bằng dung môi etyl acetate:hexan. Thổi khô dịch qua cột còn 1ml rồi phân tích bằng GC-MS. Trong 73 hợp chất thuốc trừ sâu phân tích, 45 chất có LOD < 0.005 mg/L và 28 chất có LOD = 0.01 mg/L. Khoảng tuyến tính thu đƣợc từ 0.01 - 2.0 mg/L. Phƣơng pháp sắc ký khí đầu dò bắt điện tử và đầu dò ion hoá phát xạ kết hợp với chiết pha rắn để xác định dƣ lƣợng thuốc trừ sâu lân hữu cơ trong nƣớc rửa của quá trình chế biến trái olive đã đƣợc công bố bởi M. Guardia và cộng sự [29]. Mẫu nƣớc rửa đƣợc lọc qua giấy lọc 20 m, 8 m và 0.45 m rồi cho qua cột C18, rửa giải bằng dung môi dicloromethan. Dịch rửa giải đƣợc lọc qua Na2SO4 khan, thổi khô bằng khí nitơ rồi hoà tan lại bằng 100 L quitozene 1 ppm, 200 L caffeine 1 ppm, hexan rồi phân tích bằng GC-ECD và GC-TSD. Với qui trình nhƣ trên hiệu suất thu hồi đạt từ 75 - 128% (phân tích bằng GC-ECD) và 74 - 103% (phân tích bằng GC-TSD). LOD đạt 1 - 10 ng/L (GC-TSD); 1 – 20 ng/L (GC-ECD).
Phƣơng pháp sắc ký khí là phƣơng pháp thƣờng đƣợc sử dụng để phân tích thuốc trừ sâu gốc clo hữu cơ, ƣu điểm của thiết bị này là ngoài yếu tố thời gian lƣu nhƣ trong phƣơng pháp sắc ký dùng detetor ECD, việc sử dụng detector MS , còn cung cấp thêm thông tin quan trọng khác cho việc định danh là khối phổ của hợp chất phân tích. Một lợi điểm quan trọng khác là trong trƣờng hợp có sự trùng lặp một phần hoặc toàn phần, hai hay nhiều peak đƣợc rửa giải ra cột thì việc chọn lại mảnh ion có thể giúp ta xác nhận lại hợp chất cần xác định và đồng thời cho phép định lƣợng đƣợc chúng. Chính vì vậy chúng tôi chọn phƣơng pháp này cho đề tài luận văn thạc sỹ của mình.