4. Nội dung nghiên cứu
1.3. KỸ THUẬT CHUẨN BỊ MẪU
Chuẩn bị mẫu là một khâu quan trọng trong phân tích để có độ nhạy cao đối với thuốc trừ sâu từ các nền mẫu khác nhau. Một loạt các kỹ thuật có sẵn để chuẩn bị mẫu và nồng độ thuốc trừ sâu từ nền mẫu phức tạp trƣớc khi đƣợc phát hiện. Chuẩn bị mẫu thƣờng là một quá trình gồm nhiều bƣớc liên quan đến việc lấy mẫu, làm sạch, rửa giải, vv. Các tài liệu nghiên cứu đã mô tả tƣơng đối đầy đủ các ví dụ về các kỹ thuật chuẩn bị mẫu khác nhau để phân tích dƣ lƣợng thuốc trừ sâu từ các nền mẫu khác nhau. Chiết lỏng lỏng (LLE) là một trong những kỹ thuật chiết đƣợc phát hiện sớm nhất và thƣờng đƣợc sử dụng nhất để phân tích dƣ lƣợng thuốc trừ sâu trong môi trƣờng phức tạp. Các dung môi chiết đƣợc sử dụng phổ biến nhất là acetonitril, dichlometan aceton, ethyl acetat, eter dầu hoả và metanol. Bên cạnh đó ngƣời ta thƣờng có khuynh hƣớng dùng nhiều dung môi tạo thành một hỗn hợp dung môi chiết mẫu đặc biệt là trong phân tích đa dƣ lƣợng thuốc BVTV vì nhƣ vậy sẽ hoà tan tốt các hoạt chất phân cực cũng nhƣ kém phân cực.
Vì mẫu rau, quả có hàm lƣợng nƣớc rất lớn nên cần một dung môi có khả năng hoà tan với nƣớc nhƣ acetonitrile và aceton, có thể d dàng thâm nhập sau vào nền mẫu. Sau khi chiết, nƣớc sẽ đƣơc loại ra khỏi dung dịch chiết bằng cách sử dụng một lƣợng lớn muối khan nhƣ NaCl, MgSO4 hay
Na2SO4. Sannino [62] đã chiết thuốc trừ sâu từ nền mẫu trái cây và rau bằng cách sử dụng acetone để tạo phân lớp lỏng - lỏng. LLE cũng đƣợc sử dụng để chiết dƣ lƣợng thuốc trừ sâu từ các bộ phận khác nhau của thực vật [43], [73]. Khan và cộng sự [42] đã sử dụng ethylacetate và hexane trong LLE để tách pentachloronitrobenzene và hexachlorobenzene và chất chuyển hóa của nó trƣớc khi phân tích HPLC. Baig và các cộng sự [14] đã sử dụng kỹ thuật này để chiết ba loại thuốc trừ sâu từ các mẫu rau quả.
Các phƣơng pháp chiết thông thƣờng đƣợc phổ biến nhƣng bị nhiều hạn chế nhƣ sử dụng khối lƣợng lớn dung môi, khuấy hoặc đun nóng với cùng dung môi trong thời gian dài làm tăng nguy cơ phân hủy nhiệt của nhiều thuốc trừ sâu. Nhƣng những sáng kiến mới trong lĩnh vực chiết giải quyết những mối quan tâm. Các phƣơng pháp chiết mới nhƣ chiết lò vi sóng (MAE), chiết phân tán pha rắn (Matrix Solid Phase Dispersion Extraction MSPD, vi chiết pha rắn (SPME), Phƣơng pháp QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, and Safe) đã khắc phục những vấn đề này 1 cách nhanh chóng, tiết kiệm dung môi, góp phần làm cho môi trƣờng thân thiện hơn.
Chiết siêu âm đã đƣợc sử dụng bởi Sánchez-Brunete [60] cho thuốc trừ sâu carbamate. Koc và cộng sự [43] đã thực hiện thành công sử dụng các cột florisil và rửa giải tiếp theo với hexane/dichloromethane để chiết thuốc trừ sâu.
Kỹ thuật MAE là một kỹ thuật hiệu quả để chiết dƣ lƣợng thuốc trừ sâu từ một số mẫu môi trƣờng và thực phẩm. Chen và cộng sự đã sử dụng MAE để phân tích thuốc trừ sâu clo hữu cơ.
Moreno và cộng sự [53] đã thực hiện kỹ thuật chiết vi sóng pha rắn MAME-SPE và MAME-SPME với thuốc trừ sâu clo hữu cơ. Sử dụng SPME với bốn lớp phủ khác nhau của chất xơ nhƣ poly dimethyl siloxane, poly dimethyl siloxane/divinylbenzen, nhựa Carbowax/Tempelated và polyacrylate
đƣợc làm để xác định 10 loại thuốc trừ sâu [49]. MAME-SPME cũng đƣợc sử dụng cho các nhà nghiên cứu phân tích thuốc trừ sâu clo hữu cơ. Salleh và cộng sự sử dụng SPME và SFCO2 để phân tích trực tiếp OP thuốc trừ sâu. Phân tích tự động intube SPME thuốc trừ sâu carbamate cũng đƣợc thực hiện bởi Gou và cộng sự.
Máy hỗ trợ chiết dung môi (MWASE) đã đƣợc sử dụng bởi Hogendoorn và cộng sự để phân tích multiresidue thuốc trừ sâu trong đất. Một trong những phƣơng pháp, MAME và chiết Soxhlet đã đƣợc sử dụng để xác định thuốc trừ sâu OP trong đất. Moreno và các cộng sự đã sử dụng MAE với bề mặt dùng để phân tích dƣ lƣợng thuốc trừ sâu trong đất. Singh, Foster và Khan sử dụng để xác định MAE dƣ lƣợng thuốc BVTV trong rau nấu chín và sống.
Quy trình chiết liên tục microextraction (CFME) đƣợc sử dụng bởi He và các cộng sự [33], trong đó một giọt dung môi cho vào trong một dung dịch mẫu đƣợc chảy liên tục trong một buồng kính 0,5 ml. Chất nền rắn giai đoạn phân tán (MSPD) cùng với SPE đã đƣợc sử dụng nhƣ kỹ thuật chuẩn bị mẫu của Valencia và cộng sự. Một phƣơng pháp MSPD đã đƣợc dùng để phân tích thuốc trừ sâu từ các mô trâu, bò, đƣợc chiết trên cột C18 và làm sạch bằng silicagel.
Trong thời gian gần đây chiết vi lƣợng lỏng lỏng phân tán (DLLME) là kỹ thuật trích ly phổ biến để phân tích dƣ lƣợng thuốc trừ sâu trong các mẫu lỏng. He và các cộng sự [32] đã sử dụng DLLME để chiết ion chất lỏng của thuốc trừ sâu từ các mẫu nƣớc. Kỹ thuật chiết bằng màng là một khái niệm tƣơng đối mới trong chiết thuốc trừ sâu có độ làm giàu cao. Hylton và cộng sự sử dụng màng bảo vệ để chiết dung môi hỗn hợp đƣợc tối ƣu hóa để phân tích thuốc trừ sâu. Ký thật chiết pha rắn cải tiến MEPS là một kỹ thuật sáng tạo để thu nhỏ kích thƣớc của cột SPE. Kỹ thuật này là khá thuận lợi vì nó nhanh chóng, sử dụng ít dung môi, đòi hỏi phải có cỡ mẫu nhỏ và có thể đƣợc tự
động. Quy trình MEPS đã đƣợc sử dụng để phân tích các triazine, carbamate, aldicarb, OP, clo hữu cơ và thuốc trừ sâu aryloxy phenoxy axit.
Chiết pha rắn (SPE) là một trong những kỹ thuật phổ biến nhất đƣợc sử dụng để chiết dƣ lƣợng thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ. Đây là một phƣơng pháp chuẩn bị mẫu để làm giàu và làm sạch mẫu phân tích từ dung dịch bằng cách cho chất cần phân tích hấp phụ lên một cột pha rắn sau đó chất phân tích sẽ đƣợc rửa giải bằng dung môi thích hợp. Cơ chế của quá trình lƣu giữ bao gồm phân bố pha đảo, pha thƣờng và trao đổi ion.
Ƣu điểm của phƣơng pháp SPE là khả năng làm giàu mẫu cao, giúp loại bỏ ảnh hƣởng của các chất gây nhi u, qui trình thực hiện d tự động hoá, phù hợp với phân tích sắc ký và giảm lƣợng dung môi sử dụng so với phƣơng pháp chiết lỏng - lỏng. Cột SPE có 3 loại:
- Loại chứa các pha tĩnh nhƣ C18, C8, C4, C2, cyclophenyl... là silic ghép các nhánh không phân cực dùng để tách các chất không phân cực hay ít phân cực.
- Loại chứa các chất tách nhƣ silica, florisil, amino alumina,... có ghép các nhóm nhƣ -OH, -NH2, -CN dùng chủ yếu để tách các chất tƣơng đối phân cực. Phần lớn đƣợc sử dụng để tách chiết trong điều kiện pha thƣờng (cột ghép –CN có thể sử dụng trong pha đảo).
- Loại chứa nhựa trao đổi ion để tách các hợp chất ion (cột SAX tách anion, cột SCX tách cation).
Ingelse và đồng nghiệp [36] sử dụng SPE để làm giàu các thuốc trừ sâu OP phân cực. Cột SPE với các vật liệu hấp thụ khác nhau đã đƣợc sử dụng để làm giàu hàm lƣợng thuốc trừ sâu Oasis HLB và Strata-X cho kết quả rất tốt [19]. Hàm lƣợng thuốc trừ sâu đã đƣợc làm giàu gấp 250 lần thông qua phƣơng pháp SPE đƣợc phát triển bởi Liu và cộng sự [45]. Kỹ thuật chiết SPE cũng đƣợc sử dụng cho việc phân tích thuốc trừ sâu trong nƣớc tiểu của con
ngƣời. Vật liệu carbon nano cũng đã đƣợc sử dụng cho các SPE để phân tích dƣ lƣợng thuốc trừ sâu leachable trong các mẫu nƣớc [11]. Trong nhiều phƣơng pháp khác, thuốc BVTV đã đƣợc xác bằng cách sử dụng cột C18. Một báo cáo hữu ích khác đƣợc công bố bởi Pico và cộng sự trên cơ sở phân tích các chất diệt cỏ amoni bậc bốn bằng kỹ thuật SPE. Nhiều tài liệu hiện nay cũng cho thấy SPE là một kỹ thuật làm giàu thích hợp cho loại thuốc trừ sâu có gốc Neem, Azadirachtin [38].
Chƣơng 2
PHƢƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM 2.1. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ
2.1.1. H a chất.
* ete dầu mỏ, nhiệt độ sôi từ 400C đến 600 C
* axeton – Trung Quốc
* n-hexan (loại dùng cho HPLC)
* n-heptan (loại dùng cho HPLC)
* dietyl ete của Việt Nam
* Na2SO4 khan (Trung Quốc) * Nhôm oxit (Trung Quốc)
* Silica gel (Merck, Đức)
* Chất chuẩn thuốc trừ sâu nồng độ 200 mg/L (Pesticide-Mix) * Chất nội chuẩn trifluralin 100 ppb ( g/L) (Pesticide-Mix) Các hóa chất và thuốc thử phải đạt loại tinh khiết phân tích.
2.1.2. Thiết bị và dụng cụ
* Một số dụng cụ thủy tinh phòng thí nghiệm thông thƣờng
* Máy sắc ký khí đầu dò khối phổ (GC – MS) (GCMS-QP2010-PLUS, SIMADZU)
* Máy lắc Vortex
* Bình cách thủy, có thể đun nóng đến 1000 C * Ph u lắc, dung tích khoảng 2 lit
* Các ống nghiệm để hiệu chuẩn, dung tích 15 ml và nút bằng thủy tinh * Ống sắc ký (Simadzu)
* Cột mao quản (Supelco) * Mảnh sôi; sợi thạch anh
* Cân phân tích (chính xác đến 0.0001g)
2.2. KẾ HOẠCH LẤY MẪU VÀ CHUẨN BỊ MẪU 2.2.1. Lấy mẫu 2.2.1. Lấy mẫu
Lấy mẫu đại diện, mẫu đất sau khi lấy đƣợc phơi khô tại nhiệt độ phòng. Sau đó đƣợc nghiền và rây với cỡ lỗ < 0.1mm.
Để khảo sát dƣ lƣợng các hợp chất thuốc trừ sâu, tôi lấy mẫu đất tại khu vực khảo sát là xã Bình Thủy, Bình Mỹ, Bình Chánh, huyện Châu Phú, tỉnh An Giang. Mỗi xã lấy 01 mẫu, các xã đƣợc chọn ngẫu nhiên theo hình chữ Z. Mỗi mẫu có ký hiệu riêng, có tên chủ hộ, các thông tin lấy mẫu đầy đủ. Mẫu đƣợc lấy vào ba thời điểm là sau khi phun 1 tháng, 2 tháng và sau khi thu hoạch. Mẫu sau khi lấy đƣợc bảo quản lạnh đến khi phân tích.
Đợt 1: Ngày 20/04/ 2014 STT Loại mẫu Kí hi u mẫu Số lƣợng mẫu
Địa điểm lấy mẫu Thời gian
1 Đất trồng
lúa M11 1
Hộ ông Phan Văn Lộc, xã Bình Thủy, huyện Châu Phú, tỉnh An Giang
7 giờ 30 phút
2 Đất trồng
lúa M21 1
Hộ ông Nguy n Văn Cƣờng, xã Bình Chánh, huyện Châu Phú, tỉnh An Giang 9 giờ 00 phút 3 Đất trồng lúa M31 1
Hộ ông Nguy n Văn Độ, xã Bình Mỹ, huyện Châu Phú, tỉnh An Giang
10 giờ 30 phút
ST T Loại mẫu Kí hi u mẫu Số lƣợng mẫu
Địa điểm lấy mẫu Thời gian
1 Đất trồng
lúa M12 1
Hộ ông Phan Văn Lộc, xã Bình Thủy, huyện Châu Phú, tỉnh An Giang
7 giờ 30 phút
2 Đất trồng
lúa M22 1
Hộ ông Nguy n Văn Cƣờng, xã Bình Chánh, huyện Châu Phú, tỉnh An Giang 9 giờ 00 phút 3 Đất trồng lúa M32 1
Hộ ông Nguy n Văn Độ, xã Bình Mỹ, huyện Châu Phú, tỉnh An Giang 10 giờ 30 phút Đợt 3: Ngày 15/06/ 2014 STT Loại mẫu Kí hi u mẫu Số lƣợng mẫu
Địa điểm lấy mẫu Thời gian
1 Đất trồng
lúa M13 1
Hộ ông Phan Văn Lộc, xã Bình Thủy, huyện Châu Phú, tỉnh An Giang
7 giờ 30 phút
2 Đất trồng
lúa M23 1
Hộ ông Nguy n Văn Cƣờng, xã Bình Chánh, huyện Châu Phú, tỉnh An Giang 9 giờ 00 phút 3 Đất trồng lúa M33 1
Hộ ông Nguy n Văn Độ, xã Bình Mỹ, huyện Châu Phú, tỉnh An Giang
10 giờ 30 phút
2.2.2. Bảo quản mẫu và x lý sơ bộ
Các mẫu đƣợc xử lý càng sớm càng tốt, bảo quản mẫu nơi tối nhiệt độ dƣới 10oC, bảo quản trong tủ lạnh. Mẫu khô đƣợc giữ vài tháng tại nhiệt độ phòng hoặc lâu hơn vài năm nếu đƣợc bảo quản trong tủ lạnh sâu (-180
C). Dịch chiết đƣợc giữ đƣợc trong tủ lạnh (40C) trong vòng 1 tháng. Nếu mẫu không đồng nhất, nghiền mẫu để thu đƣợc mẫu thử đại diện.
2.2.3. Chuẩn bị mẫu
- Mẫu trắng: Sử dụng mẫu đã đƣợc khẳng định hoàn toàn không có các chất cần phân tích để làm mẫu trắng.
- Mẫu giới hạn phát hiện: Mẫu giới hạn phát hiện đƣợc chuẩn bị bằng cách thêm chuẩn vào mẫu trắng sao cho hàm lƣợng các chất cần phân tích chứa trong mẫu là 1g/kg.
- Mẫu kiểm soát: Thêm vào mẫu trắng một lƣợng chuẩn của các chất cần phân tích sao cho hàm lƣợng của các chất cần phân tích chứa trong mẫu là 25g/kg.
- Mẫu thử: Tiến hành đồng nhất mẫu, giữ mẫu trong tủ lạnh ở 50C hoặc thấp hơn cho đến khi phân tích.
2.3. CHIẾT VÀ CÔ MẪU 2.3.1. Chiết mẫu 2.3.1. Chiết mẫu
Lấy 20 g mẫu đông lạnh cho vào bình nón. Cho thêm 50 ml axeton vào mẫu thử và chiết bằng cách lắc kỹ trong 15 phút trên máy lắc. Sau đó thêm 50 ml ete dầu mỏ và lắc lại trong 15 phút. Lặp lại bƣớc chiết lần nữa với 50 ml ete dầu mỏ. Thu lấy dịch chiết vào ph u tách dung tích 2 lit và loại bỏ axeton bằng cách lắc hai lần với mỗi lần 500 ml nƣớc. Làm khô dịch chiết bằng natri sulfat khan và chuyển dịch chiết đã làm khô vào bình ngƣng tụ. Tráng natri sulfat ba lần bằng 10 ml ete dầu mỏ và gộp dung dịch rửa vào dịch chiết.
2.3.2.Cô đặc
Cho mảnh sôi vào dịch chiết và cô đặc dịch chiết đến còn khoảng 10 ml. Chuyển dịch chiết đã cô đặc vào ống nghiệm hiệu chuẩn và cô đặc tiếp đến 1 ml dùng dòng khí nitơ thổi nh đến nhiệt độ phòng.
2.4. LÀM SẠCH DỊCH CHIẾT
Chuẩn bị cột hấp phụ bằng cách đặt một cái nút nhỏ làm bằng sợi thạch anh vào ống sắc ký và nhồi, làm khô với 2,0 g 0,1 g oxit nhôm.
Trƣớc khi sử dụng, cách thức rửa giải cho mỗi dãy cột oxit nhôm và thể tích dung dịch rửa giải cần dùng phải đƣợc kiểm chứng bằng dung dịch chuẩn OCP.
Dùng pipet, chuyển dịch chiết vào cột hấp phụ đã đƣợc nhồi và làm khô, rửa ống thử nghiệm hai lần bằng 1 ml ete dầu mỏ và chuyển dịch rửa vào cột bằng pipet cùng loại ngay khi mức chất lỏng chạm đến mặt trên cột nhồi. Rửa giải dùng khoảng 20 ml ete dầu mỏ.
Chia dung dịch rửa giải thành là hai phần bằng nhau và một phần lƣu giữ cho phân tích dịch chiết đƣợc pha loãng cho sau này. Cô đặc phần còn lại bằng dòng nitơ thổi nh , không cần đun nóng, tới thể tích cuối cùng khoảng 1ml.
Cho vào dịch chiết cuối cùng 10 l dung dịch bơm chuẩn có nồng độ gấp 100 lần dung dịch bơm chuẩn có 1 ml trong dung dịch chuẩn làm việc nghĩa là tƣơng đƣơng với 1 ml dung dịch chuẩn làm việc.
2.5. TÁCH OCP KHÔNG PHÂN CỰC RA KHỎI MỘT SỐ OCP PHÂN CỰC BẰNG SẮC KÝ CỘT
Trong trƣờng hợp mẫu phức tạp, việc phân tách bằng phân tích sắc ký khí có thể không hoàn toàn. Trong trƣờng này cần phân tách bằng cách sắc ký bổ sung sử dụng toàn bộ dịch chiết đã cô đặc.
Toàn bộ dịch chiết đã đƣợc phân tách bằng sắc ký cột silicagel thành hai phần. Phần thứ nhất chứa OCP không phân cực (HCB, p,p’-DDT, heptaclo, aldrin). Phần thứ hai chứa nhiều OCP phân cực hơn (α-HCH, β- HCH, γ-HCH, đielrin, endrin, o,p’-DDD). Kiểm tra cách thức rửa giải bằng dung dịch chuẩn OCP.
Tách dịch chiết nhƣ sau: đặt một cái nút nhỏ bằng sợi thạch anh vào ống sắc ký. Đậy nút và làm khô bằng (1,5 g 0,1 g) silicagel và phủ 1 cm natri sulfat lên trên. Dùng pipet chuyển dịch chiết đã cô đặc vào cột đã chuẩn bị và làm khô. Tráng ống nghiệm hai lần, mỗi lần 1 ml hexan. Dùng cùng pipet chuyển dung dịch tráng vào cột ngay khi mức chất lỏng chạm tới đƣờng rìa trên của cột nhồi. Rửa giải bằn cách lần lƣợt thêm vào cột 25 ml hexan (phần 1) và 25 ml hỗn hợp hexan và ete đietyl (tỉ lệ thể tích 75:25) (phần 2).
Chia mỗi dung dịch rửa giải thành hai phần bằng nhau, và đối với từng phần dung dịch rửa giải, lƣu giữ lại một phần cho các phân tích. Làm bay hơi hai phần riêng biệt trong ống nghiệm có dung tích 1 ml.
Cho vào dịch chiết cuối cùng 10 l dung dịch bơm chuẩn có nồng độ