các lá bị khô hoàn toàn 20-39
9 Lá cuốn chặt Cây gần như chết 0-19
2.2.3. Phương pháp phân tích ña hình di truyền bằng chỉ thị phân tử SSR
Phương pháp tách chiết ADN
ADN ñược tách chiết từ lá non sử dụng phương pháp tách nhanh NaOH Extraction phục vụ cho PCR (Wang và cs., 1993):
- Lấy mẫu lá lúa non ñã rửa sạch (khoảng vài mg), cắt nhỏ bằng kéo vô trùng cho vào ống eppendorf 2,0 ml. Bổ sung thêm bi nghiền.
36
- Sử dụng máy nghiền quay ở chếñộ 30 rps trong 3 phút cho ñến khi thu ñược dung dịch ñồng thể.
- Cho tiếp 800 µl Tris HCl pH 7,5.
- Trộn ñều nhẹ nhàng bằng cách ñảo ngược ống, sau ñó li tâm 12000 rpm trong 15 phút ở 4oC.
- Hút 200 µl phần dịch trên sang ống eppendorf 1,5 ml mới. - Dịch ADN gốc ñược bảo quản ở -20oC.
Pha loãng ADN:
- Dịch ADN gốc ñược pha loãng 20 lần (5 µl ADN gốc + 95 µl H2O). - Mỗi lần tiến hành phản ứng PCR sử dụng 5 µl ADN ñã pha loãng (ADN làm việc).
Kỹ thuật PCR
ADN ñã pha loãng ñược dùng ñể thực hiện phản ứng PCR với các mồi SSR. Thành phần phản ứng của một phản ứng PCR như sau:
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR
Phản ứng PCR ñược tiến hành trên máy chu kỳ nhiệt (Vertiti 96 wells Thernal Cycler). Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ñược cài ñặt như sau:
Thành phần Thể tích (µl) dH2O 4,8 Buffer(10X) 1,5 MgCl2 (25mM) 1,0 dNTPs (2,5mM) 1,2 Taq TaKaRa(1:50) 0,3 Primer 15ng/µl 1,2 ADN (30ng/µl) 5,0 Tổng thể tích 15,0
37
Bảng 2.4. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Các bước Nhiệt ñộ (0C) Thời gian (phút) Số chu kỳ Tác dụng
1 94 5 1 Biến tính 2 94 55 72 0,5 0,5 1 35 Biến tính Gắn mồi Tổng hợp 3 72 7 1 Tổng hợp 4 4 ∞ Bảo quản
Phương pháp ñiện di trên gel agarose SFR
Phương pháp ñiện di sản phẩm PCR dựa theo phương pháp của Khoa Genome thực vật, ðại học Công nghệ Texas, Mỹ (2002) (http://www.methodbook.net/dna/agarogel.html):
- Sản phẩm PCR ñược tiến hành ñiện di trên gel agarose SFR 3% chứa Ethidium bromide 10 (mg/ml) với thang ADN chuẩn (ladder) ở hiệu
ñiện thế 90V trong 3 giờ cho ñến khi băng màu xanh Bromophenol gần ra khỏi bản gel.
- Dung dịch ñệm chạy ñiện di ñược sử dụng là 0,5X TBE.
2.2.4. Phương pháp phân tích số liệu
Phương pháp phân tích số liệu kiểu hình
Số liệu ñánh giá kiểu hình chịu hạn của quần thể F2:3 ñược xử lý thống kê theo chương trình Excel 2007.
Phương pháp phân tích số liệu kiểu gen
Thông tin về nguồn gốc các giống lúa, các chỉ thị phân tử SSR ñược thu thập và phân tích dựa trên các tài liệu ñã công bố trong nước và trên thế
giới, các trang website chuyên ngành như website của Viện nghiên cứu lúa quốc tế - IRRI (www.irri.org), website Cơ sở dữ liệu về Lúa – GRAMENE (www.gramene.org)...
38
Dữ liệu phân tích kiểu gen ñược xử lý thống kê theo phần mềm IRRI- STAT 4.0
Hệ số di truyền theo nghĩa rộng ñược tính theo công thức: