1.3.2.1. Khái niệm về bản ñồ liên kết
Bản ñồ liên kết có thể ñược hiểu ñơn giản là sơ ñồ chi tiết trên nhiễm sắc thể từ hai bố mẹ khác nhau. Bản ñồ liên kết ñịnh vị các vị trí và sự tương quan về khoảng cách di truyền giữa các chỉ thị chạy dọc theo chiều dài nhiễm sắc thể. ðiểm quan trọng nhất là bản ñồ liên kết cho phép xác ñịnh các vị trí trên nhiễm sắc thể chứa các QTL/ gen liên quan ñến các tính trạng mục tiêu; vì thế nên có tên gọi khác là bản ñồ di truyền hay bản ñồ QTL.
Lập bản ñồ QTL dựa trên nguyên tắc các gen và chỉ thịñược phân chia thông qua sự tái tổ hợp nhiễm sắc thể trong quá trình giảm phân (ở loài sinh sản hữu tính), từñó cho phép nghiên cứu quy luật di truyền thông qua các ñời sau. Các gen và chỉ thị càng gần nhau hay liên kết chặt ñược di truyền cùng nhau từ thế hệ bố mẹ sang các thế hệ sau nhiều hơn là các gen/ chỉ thị ở
18
Hình 1.1: Sơ ñồ thể hiện sự tái tổ hợp giữa các nhiễm sắc thể tương ñồng xảy ra trong quá trình giảm phân (Collard B. và Jahufer M., 2005)
Giao tửñược tạo ra sau giảm phân từ từ bố mẹ còn lại (P) hoặc do tái tổ hợp (R). Khoảng cách giữa hai chỉ thị càng nhỏ, cơ hội xảy ra quá trình tái tổ hợp giữa chúng càng thấp. Vì vậy, sự tái tổ hợp giữa chỉ thị G và H có thể xảy ra thường xuyên hơn so với giữa chỉ thị E và F. ðiều này có thể ñược quan sát bằng sự phân ly ở quần thể con. Bằng những phân tích về sự phân ly trong quần thể, chỉ thị E và F ñược xác ñịnh là gần nhau hơn so với chỉ thi G và H.
Tần số tái tổ hợp kiểu gen thường dùng ñể xác ñịnh mối liên quan giữa các chỉ thị thông qua khoảng cách di truyền giữa chúng (tính bằng cM). Tần số tái tổ hợp giữa hai chỉ thị càng thấp, chúng càng gần nhau trên nhiễm sắc thể, và ngược lại – tần số tái tổ hợp giữa chúng càng lớn, chúng càng cách xa nhau trên nhiễm sắc thể. Các chỉ thị có tần số tái tổ hợp 50%, gọi là không liên kết và ñược cho là ñịnh vị cách xa trên cùng nhiễm sắc thể ñó hoặc nằm trên các nhiễm sắc thể khác. Xây dựng bản ñồ liên kết thường ñược tiến hành theo ba bước chính: (1) tạo lập quần thể lập bản ñồ; (2) khảo sát sựña hình di truyền; và (3) phân tích chỉ thị liên kết.
1.3.2.2. Tạo lập quần thể lập bản ñồ
Việc xây dựng bản ñồ liên kết yêu cầu một quần thể cây trồng mục tiêu
ñược cách ly. Các dòng bố/ mẹ ñược lựa chọn cho việc tạo lập quần thể sẽ
mang một hay nhiều tính trạng mong muốn. Kích thước quần thể sử dụng trong các nghiên cứu lập bản ñồ di truyền thường nằm trong khoảng 50 – 250
19
cá thể (Mohan và cs., 1997), tuy nhiên lập bản ñồ với ñộ phân giải càng cao thì ñòi hỏi kích thước quần thể phải càng lớn. Lập bản ñồ di truyền phải tiến hành ñánh giá tính trạng kiểu hình trước khi phân tích QTL trên genôm.
Người ta thường sử dụng quần thểñể lập bản ñồ di truyền ñặc trưng tùy từng ñối tượng cây trồng nghiên cứu khác nhau, với những ưu ñiểm và nhược
ñiểm nhất ñịnh của chúng (McCouch và Doerge, 1995). Quần thể F2 ñược tạo ra từ F1, và quần thể lai trở lại BC từ F1 lai với một trong hai bố mẹ, là hai quần thể ñiển hình và ñơn giản nhất trong công tác tạo lập bản ñồ các loài tự thụ
phấn. Lợi thế chính của các quần thể này là dễ dàng xây dựng trong một khoảng thời gian ngắn. Tự thụ phấn các cá thể F2 cho phép tạo ra các dòng cận giao tái tổ hợp (RIL) chứa duy nhất sự tổ hợp các ñoạn nhiễm sắc thể từ các bố
mẹ ban ñầu. Quần thể ñơn bội kép (DH) ñược tạo ra bằng cách tái sinh cây trồng bằng cảm ứng, làm cho bộ nhiễm sắc thể tăng gấp ñôi từ các hạt phấn. Lợi thế lớn nhất của quần thể RIL và DH là chúng có thể tạo ra các dòng ñồng hợp tử, các dòng này có thể ñược nhân lên hoặc sao chép mà không làm thay
ñổi vật chất di truyền. ðiều này cho phép tiến hành thử nghiệm các thí nghiệm lặp ñi lặp lại ở các ñịa ñiểm và thời gian khác nhau mà không ảnh hưởng. Vì vậy, quần thể RIL và DH ñược coi là nguồn vật liệu “vĩnh cửu” cho việc lập bản ñồ QTL.
20
(Collard B. và Jahufer M., 2005)
1.3.2.3. Xác ñịnh ña hình di truyền
Hình 1.3. Bản ñiện di các chỉ thị ADN giữa kiểu gen A, B, C và D (Collard B. và Jahufer M., 2005)
Các chỉ thịña hình ñược chú thích bằng dấu mũi tên.
(a) Ví dụ về chỉ thị SSR. Các chỉ thịña hình cho các kích thước băng khác nhau cho các alen ở cả bốn kiểu gen, ñại diện cho một locus ñơn.
(b) Ví dụ về chỉ thị RAPD. Kích thước của các chỉ thịñược tính bằng các bp, ño bằng thang ADN ladder.
(c), (d) Chỉ thịñồng trội cho biết chính xác sự khác nhau giữa ñồng hợp tử và dị hợp tử, trong khi chỉ thị trội thì không. Kiểu gen giữa hai loci (A và B) ñược thể hiện trên bản gel.
Bước thứ hai ñể tạo lập bản ñồ liên kết là xác ñịnh những chỉ thị ADN
ña hình cho thấy sự khác nhau giữa bố/ mẹ. Việc thu thập ñủ những chỉ thị
cho ña hình giữa bố/ mẹ rất quan trọng ñể có thể lập nên một bản ñồ liên kết (Young, 1994). Việc sử dụng chỉ thị ADN ñể phân tích lập bản ñồ phụ thuộc vào ñặc tính và sự phù hợp của chúng với những loài cụ thể nào ñó. Các chỉ
thị phân tử ADN thường tồn tại ở hai dạng là chỉ thịñồng trội và chỉ thị trội. Khi các chỉ thị cho ña hình ñược xác ñịnh, chúng ñược kiểm tra trên toàn bộ quần thể lập bản ñồ, bao gồm cả các dòng bố/ mẹ (và các dòng lai F1, nếu cần thiết), quá trình này gọi là khảo sát ña hình quần thể. Các số liệu thống kê có thể ñược phân tích bằng cách sử dụng các kiểm ñịnh giả thuyết.
21 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trên thực tế, các chỉ thị sẽ tuân theo quy luật di truyền của Menden mặc dù số
liệu phân ly kiểu gen có thể bị sai khác (Sayed và cs., 2002).
1.3.2.4. Phân tích chỉ thị liên kết
Bước cuối cùng trong việc xây dựng bản ñồ liên kết là việc mã hóa dữ
liệu cho mỗi chỉ thị ADN trên quần thể và tiến hành phân tích liên kết sử dụng các phần mềm trên máy tính. Các dữ liệu bị khuyết trong ñiều kiện cho phép có thể ñược chấp nhận trong các chương trình lập bản ñồ. Việc phân tích liên kết có thể ñược thực hiện thủ công cho một vài chỉ thị, tuy nhiên sẽ không khả thi nếu tiến hành phân tích và xác ñịnh liên kết cho một số lượng lớn các chỉ thị ñược khảo sát bằng thủ công; vì thế mà cần phải ứng dụng công nghệ phần mềm ñể giải quyết bài toán này.
Các phần mềm miễn phí thường ñược sử dụng bao gồm Mapmaker/EXP (Lander và cs., 1987; Lincoln và cs., 1993) và MapManager QTX (Manly và cs., 2001), ngoài ra còn có JoinMap cũng là một phần mềm thông dụng ñược sử dụng trong việc lập bản ñồ liên kết (Stam, 1993).
Các chỉ thị liên kết với nhau ñược tập hợp lại thành một nhóm liên kết,
ñược thể hiện ở một ñoạn hoặc toàn bộ nhiễm sắc thể. Trên bản ñồ chi tiết nhiễm sắc thể, nhóm liên kết ñược ghi chú là một vùng, trong khi chỉ thị liên kết ñược quy ước là các dấu hiệu hoặc cột mốc trên vùng ñó. Khó khăn trong thu thập số
lượng nhóm liên kết là các chỉ thịña hình ñược phát hiện không chắc chắn ñược
ñịnh vịñồng ñều trên nhiễm sắc thể, chúng có thể tụ tập trong một vài vùng ñặc hiệu, và không có ở những vùng khác. Bên cạnh việc ñịnh vị không ngẫu nhiên của các chỉ thị, tần số tái tổ hợp tại các vị trí cũng không giống nhau trên toàn bộ
nhiễm sắc thể (Young, 1994). Sự chính xác trong việc tính toán khoảng cách di truyền và vị trí của các chỉ thị phụ thuộc trực tiếp vào số lượng cá thể nghiên cứu trong quần thể lập bản ñồ.
22
Hình 1.4. Ứng dụng phần mềm trong lập bản ñồ liên kết (Manly và cs., 2001).
Lập bản ñồ liên kết dựa vào một quần thể RI gồm 20 cá thể. Bố (mẹ) P1ñược cho ñiểm ‘A’, P2ñược cho ñiểm ‘B’. Mã hóa dữ liệu các con lai phụ thuộc vào kiểu gen của chúng. Sau ñó, bản ñồ liên kết ñược tạo ra nhờ sử dụng chức năng Haldane mapping của phần mềm Map Manager QTX
1.3.2.5. Khoảng cách di truyền và lập bản ñồ chức năng
Vai trò của khoảng cách giữa các gen và các chỉ thịñược các nhà khoa học ñưa ra phân tích từ rất sớm. Khoảng cách giữa các chỉ thị càng xa, khả
năng tái tổ hợp giữa chúng trong quá trình giảm phân càng cao. Khoảng cách theo chiều dọc trong một bản ñồ liên kết ñược tính toán tần số tái tổ hợp giữa các chỉ thị di truyền. ðể lập bản ñồ chức năng, cần phải ñổi các thông số sang
ñơn vị centiMorgans (cM) bởi vì tần số tái tổ hợp và tần số trao ñổi chéo không có sự tuyến tính với nhau. Khi khoảng cách trong bản ñồ nhỏ (<10 cM), chúng ñược tính bằng tần số tái tổ hợp. Sự tương quan này không áp dụng khi khoảng cách trong bản ñồ lớn hơn 10 cM. Hai công cụ thường ñược sử dụng ñể
lập bản ñồ là chức năng lập bản ñồ Kosambi (giả ñịnh rằng các sự kiện tái tổ
hợp ảnh hưởng ñến sự xuất hiện của các sự tiếp tái tổ hợp liền kề), và chức năng lập bản ñồ Haldane (giảñịnh rằng không có sự tương tác giữa các sự kiện
23
trao ñổi chéo).
Khoảng cách trong bản ñồ liên kết không liên quan trực tiếp ñến khoảng cách vật lý trên phân tử ADN giữa các chỉ thị di truyền, nó phụ thuộc vào kích thước genôm của loài. Mối quan hệ giữa khoảng cách di truyền và khoảng cách vật lý là khác nhau trên một nhiễm sắc thể (Tanksley và cs., 1992; Young, 1994).