1.3.3.1. Nguyên tắc phân tích QTL
Phân tích QTL dựa trên nguyên tắc là xác ñịnh sự liên kết giữa kiểu gen và kiểu hình của các chỉ thị. Các chỉ thịñược sử dụng ñể phân vùng quần thể
lập bản ñồ thành những nhóm kiểu gen khác nhau, dựa trên kết quả ñiện di các băng, xác ñịnh những sai khác có ý nghĩa giữa các nhóm này với các tính trạng ñược ño ñếm (Tanksley, 1993; Young, 1996). Sự sai khác có ý nghĩa giữa giá trị trung bình kiểu hình với hệ thống các chỉ thị và loại quần thể lập bản ñồ chỉ ra các chỉ thị nào ñược sử dụng ñể phân vùng quần thể liên kết với một QTL ñiều khiển tính trạng mục tiêu.
Hình 1.5: Nguyên tắc lập bản ñồ QTL (Young, 1996)
Các chỉ thị liên kết với một gen hoặc QTL ñiều khiển tính trạng cụ thể (ởñây là chiều cao cây) ñược chỉ ra sự sai khác có ý nghĩa khi quần thểñược phân nhóm dựa theo kiểu gen của chỉ thị. Dựa vào kết quảở kết quảñiện di, chỉ thị E liên kết với một QTL bởi vì có sự sai khác ý nghĩa giữa các giá trị trung bình. Chỉ thị H không liên kết với QTL vì không có sự sai khác có ý nghĩa giữa các giá trị trung bình. Các chỉ thị càng gần QTL nghiên cứu, khả năng tái tổ hợp giữa chỉ thị và QTL càng thấp.
24
trung bình của tính trạng cho phép xác ñịnh sự liên kết giữa chỉ thị và QTL? Câu trả lời là do quá trình tái tổ hợp. Các chỉ thị càng gần một QTL thì cơ hội xảy ra tái tổ hợp giữa chỉ thị và QTL càng thấp. Vì vậy, QTL và chỉ thị sẽ
thường xuyên ñược di truyền cùng nhau ở các thế hệ sau này, và giá trị trung bình của nhóm liên kết sẽ có sai khác có ý nghĩa (P < 0,05 %) với giá trị trung bình của nhóm không có chỉ thị liên kết (Hình 1.6). Khi chỉ thị liên kết lỏng lẻo hoặc không liên kết với QTL, sự phân chia giữa chỉ thị và QTL ñó diễn ra
ñộc lập. Trong trường hợp này, có sự sai khác không có ý nghĩa giữa các giá trị trung bình của các nhóm kiểu gen (thể hiện ở các băng trên kết quả ñiện di). Các chỉ thị không liên kết nằm ở vùng cách xa hoặc trên nhiễm sắc thể
khác với QTL ñược kế thừa một cách ngẫu nhiên với QTL ñó ở các thế hệ sau này; vì vậy, sự sai khác không có ý nghĩa giữa giá trị trung bình của các nhóm kiểu gen sẽñược phát hiện.
Hình 1.6: Sơ ñồ thể hiện mối liên kết giữa chỉ thị và QTL (Collard B. và Jahufer M., 2005)
(a): Sự kiện tái tổ hợp xảy ra giữa QTL và chỉ thị loci.
(b): Các loại giao tử trong quần thể. Các chỉ thị liên kết chặt với QTL (chỉ thị E) ñược kế thừa cùng với QTL ở các thế hệ sau. Các chỉ thị liên kết lỏng lẻo với QTL (chỉ thị H) ñược kế thừa một cách ngẫu hứng với QTL.
25
1.3.3.2. Phương pháp xác ñịnh QTL
Có ba phương pháp thường ñược áp dụng ñể xác ñịnh các QTLs là phân tích chỉ thị ñơn, lập bản ñồ ñoạn ñơn. Phân tích chỉ thị ñơn (hay phân tích chỉ thịñiểm) là phương pháp ñơn giản nhất ñể xác ñịnh các QTLs liên kết với các chỉ thị ñơn. Xử lý thông kê ñược dùng trong phương pháp này bao gồm kiểm ñịnh, phân tích phương sai ANOVA, hồi quy tuyến tính. Phương pháp hồi quy tuyến tính ñược sử dụng nhiều nhất bởi hệ số xác ñịnh (% R2) từ
chỉ thị giải thích cho sự biến ñổi kiểu hình phát sinh từ QTL liên kết với chỉ
thị ñó. Phương pháp này không yêu cầu một bản ñồ liên kết ñầy ñủ, có thể ñược thực hiện với những chương trình thống kê ñơn giản. Tuy nhiên, nhược
ñiểm chính của phương pháp hồi quy tuyến tính là các QTL càng cách xa chỉ
thị bao nhiêu thì càng ít có khả năng phát hiện ra mối liên kết giữa QTL với chỉ thị ñó. ðiều này ñược giải thích bởi quá trình tái tổ hợp có thể xuất hiện giữa chỉ thị và QTL ñó, nó làm cho mức ñộ tác ñộng của QTL bị ñánh giá thấp. Việc sử dụng một số lượng lớn bao phủ lên toàn bộ genôm (thường cách nhau ít nhất là 15 cM) có thể làm giảm bớt những vấn ñề này (Tanksley, 1993).
Phương pháp lập bản ñồ ñoạn ñơn (SIM) ñược sử dụng ñể lập bản ñồ
liên kết và ñồng thời phân tích những khoảng giữa các cặp chỉ thị liên kết liền kề nhau dọc trên chiều dài nhiễm sắc thể thay vì phân tích những chỉ thị ñơn. Việc sử dụng các chỉ thị liên kết làm bù lại sự tái tổ hợp giữa các chỉ thị - QTL, và thường ñược coi là có tính thống kê thuyết phục hơn so với phân tích
ñơn ñiểm (Lander và Botstein, 1989). Các nhà khoa học thường sử dụng chương trình MapMaker/QTL (Lincoln và cs., 1993) và QGene (Nelson, 1997) ñể tiến hành phân tích SIM.
Gần ñây, phương pháp lập bản ñồ ñoạn tổng hợp (CIM) trở nên phổ
26
bản ñồ các ñoạn với hồi quy tuyến tính và bao gồm các chỉ thị di truyền bổ
sung trong mô hình thống kê ñược thêm vào cùng với các cặp chỉ thị liền kề
nhau trong phân tích CIM (Jansen, 1993; Jansen và Stam, 1994; Zeng, 1993, 1994). Lợi thế chính của CIM là phương pháp này chính xác và hiệu quả hơn rất nhiều so với phương pháp phân tích ñơn ñiểm và lập bản ñồñoạn ñơn, ñặc biệt khi các QTLs liên kết ñược tham gia. Rất nhiều công trình sử dụng các phần mềm như QTL Cartographer (Basten và cs., 2001), MapManager QTX (Manly và cs., 2001) và PLABQTL (Utz và Melchinger, 1996) ñể tiến hành phương pháp CIM.