Để khẳng định chắc chắn cấu trúc của các chất đã tổng hợp được, chúng tôi
đã đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) và phổ khối lượng phân tử
(MS) cả 5 chất: I, II, III, IV và V tại Phòng Phân tích phổ -Viện Hóa học -Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và tại Phòng Hóa vật liệu – Khoa Hóa – Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội. Phổ đồ của các chất được trình bày theo thứ tự của từng chất ở các phụ lục (2-4, 6-8, 10-12, 14-16, 18-20).
Kết quả phân tích phổ1H-NMR được ghi trong bảng 3.8, 3.9, 3.10, 3.11, 3.12. Các
số liệu phân tích phù hợp với các tài liệu tham khảo [2].
Bảng 3.8. Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của sản phẩm N- benzylsuccinimid (1H-NMR, DMSO)
Độ chuyển dịch hóa học (δ, ppm) Dạng proton
2,68 (4H, s, H-3, H-4) -CH2-CH2- 4,53 (2H, s, H-1’) Ar-CH2-N 7,24-7,26(3H,m, H-2’’, H-4’’, H-6’’) =CH thơm 7,29-7,32 (2H, m, H-3’’, H-5’’) =CH thơm
Ghi chú: s - singlet, m - multiplet, Ar - nhân thơm
Trên phổ khối lượng quan sát thấy pic phân tử là: [M+H]+ (m/z 190,01) và [M+Na]+ (m/z 212,02). Điều này phù hợp với công thức phân tử của sản phẩm dự kiến là C11H11NO2 (M = 189,21).
Bảng 3.9. Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của sản phẩm N- benzylphthalimid (1H-NMR, DMSO)
Độ chuyển dịch hóa học (δ, ppm) Dạng proton
4,77 (2H, s, H-1’) Ar-CH2-N 7,26-7,34 (5H, m, H-2’’, H3’’, H-4’’, H-
5’’, H-6’’) =CH thơm
7,82-7,86 (2H, m, H-5, H-6) =CH thơm 7,87-7,90 (2H, m, H-4, H-7) =CH thơm
Trên phổ khối lượng quan sát thấy pic phân tử là: [M+H]+ (m/z 238,00) và [M+Na]+ (m/z 260,02). Điều này phù hợp với công thức phân tử của sản phẩm dự kiến là C15H11NO2 (M = 237,25).
Bảng 3.10. Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của sản phẩm N- phthaloyl -L-tyrosin (1H-NMR, DMSO)
Độ chuyển dịch hóa học (δ, ppm) Dạngproton
3,23 (1H, dd, J1 = 12,0, J2 = 14,0 Hz, Hα-3) -CH2- 3,35 (1H, dd, J1 = 5,0 J2 = 14,0 Hz, Hβ-3) 5,00 (1H, dd, J1 = 5,0, J2 = 12,0 Hz, H-2) -CH-N 6,53 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3’, H-5’) =CH thơm 6,91 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-2’, H-6’) =CH thơm 7,83 (4H, s, H-4’’, H-5’’, H-6’’, H-7’’) =CH thơm
Ghi chú: d - doublet, dd - doublet của doublet
Trên phổ khối lượng quan sát thấy pic phân tử là: [M+H]+ (m/z 312,04) và [M+Na]+ (m/z 334,01). Điều này phù hợp với công thức phân tử của sản phẩm dự
kiến là C17H13NO5 (M = 311,29).
Bảng 3.11. Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của sản phẩm N- phthaloyl-3’-nitro-L-tyrosin (1H-NMR, DMSO)
Độ chuyển dịch hóa học (δ, ppm) Dạng proton
3,27 (1H, dd, J1 = 11,5, J2 = 14,0 Hz, Hα-3) -CH2- 3,44 (1H, dd, J1 = 4,5, J2 = 14,0 Hz, Hβ-3) 5,11 (1H, dd, J1 = 4,5, J2 = 11,5 Hz, H-2) -CH-N 6,93 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5’) =CH thơm 7,34 (1H, dd, J1 = 2,0, J2 = 8,5 Hz, H-6’) =CH thơm 7,68 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2’) =CH thơm 7,85 (4H, m, H-4’’, H-5’’, H-6’’, H-7’’) =CH thơm 10,73 (1H, s, OH) -OH phenol
Trên phổ khối lượng quan sát thấy pic phân tử là: [M+H]+ (m/z 357,00) và [M+Na]+ (m/z 378,98). Điều này phù hợp với công thức phân tử của sản phẩm dự
Bảng 3.12. Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của sản phẩm N- phthaloyl-3’,5’-dinitro-L-tyrosin (1H-NMR, DMSO)
Độ chuyển dịch hóa học (δ, ppm) Dạng proton
3,33 (1H, dd, J1 = 11,0, J2 = 14,0 Hz, Hα-3) -CH2- 3,53 (1H, dd, J1 = 5,0, J2 = 14,0 Hz, Hβ-3) 5,20 (1H, dd, J1 = 5,0, J2 = 11,0 Hz, H-2) -CH-N 7,84-7,88 (4H, m, H-4’’, H-5’’, H-6’’, H-7’’) =CH thơm 8,09 (2H, s, H-2’, H-6’) =CH thơm
Trên phổ khối lượng quan sát thấy pic phân tử là: [M+H]+ (m/z 401,96) và [M+Na]+ (m/z 423,94). Điều này phù hợp với công thức phân tử của sản phẩm dự
kiến là C17H11N3O9 (M = 401,28).
Nhận xét: Các kết quả phân tích phổ1H-NMR và MS ở trên cho phép chúng tôi khẳng định cấu trúc của 5 sản phẩm imid tổng hợp được là hoàn toàn phù hợp với dự kiến.
3.6. Thử tác dụng sinh học
Để tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học cao, có triển vọng trong sử dụng làm thuốc, chúng tôi đã tiến hành thử tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm của các chất I, II, III, IV và V. Phép thử được thực hiện tại bộ môn Vi sinh-Sinh học, Trường Đại học Dược Hà Nội.
3.6.1. Nguyên tắc
Thử tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm được tiến hành theo phương pháp khuếch tán trên thạch. Mẫu thử (có chứa hoạt chất thử) được đặt lên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy vi sinh vật kiểm định, hoạt chất từ mẫu thử khuếch tán vào môi
trường thạch sẽ ức chế sự phát triển của vi sinh vật kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn hoặc vòng vô nấm.
3.6.2. Cách tiến hành
a. Các vi sinh vật sử dụng trong thử nghiệm
Bộ môn Vi sinh - Sinh học, Trường Đại học Dược Hà Nội tiến hành thử tác dụng kháng khuẩn với 5 vi khuẩn Gram(+) và 5 vi khuẩn Gram(-), thử tác dụng kháng nấm với 2 vi nấm:
+ Vi khuẩn Gram(-) gồm:
- Escherichia coli ATCC 25922 (EC)
- Proteus mirabilis BV 108 (Pro)
- Shighella flexneri DT 112 (Shi)
- Salmonella typhi DT 220 (Sal)
- Pseudomonas aeruginosa VM 201 (Pseu) + Vi khuẩn Gram(+) gồm:
- Staphylococcus aureus ATCC 1128 (Sta)
- Bacillus pumilus ATCC 10241 (Bp)
- Bacillus subtilis ATCC 6633 (Bs)
- Bacillus cereus ATCC 9946 (Bc)
- Sarcina lutea ATCC 9341 (SL) + Vi nấm kiểm định gồm:
- Candida albicans (Ca)
- MX
Kháng sinh đối chiếu: Streptomycin (Strep) 20µg/ml và Penicillin (Peni) 20 µg/ml đối với thử nghiệm kháng khuẩn và fluconazol (flu) 500µg/ml đối với thử
nghiệm kháng nấm.
Bảng 3.13. Các môi trường trong thử nghiệm kháng khuẩn và kháng nấm:
Kháng khuẩn Kháng nấm
Canh thang nuôi
cấy VK Thạch thường Sabouraud lỏng nuôi cấy C. albicans Thử nghiệm Sabouraud - NaCl 0,5% - Cao thịt 0,3% - Pepton 0,5% - Nước cất vừa đủ 100ml. - NaCl 0,5% - Thạch 1,6% - Pepton 0,5% - Nước cất vừa đủ 100ml. - Pepton 1,0% - Glucose 2,0% - Nước cất vừa đủ 100ml. - Pepton 1,0% - Glucose 2,0% - Thạch 1,6% - Nước cất vừa đủ 100ml. c. Tiến hành Lần 1 thử cả 5 chất
Mẫu thửđược pha vào dung môi thích hợp (ethanol) với nồng độ 100µg/ml. Các chất đối chiếu cũng được pha vào dung môi thích hợp gồm: Penicillin 20µg/ml, Streptomycin 20µg/ml và fluconazol 500µg/ml.
+ Các khoanh giấy lọc vô trùng và đã được sấy khô được tẩm 3 lần với dung dịch mẫu thử gồm: mẫu chất I, II, III, IV và V, sau mỗi lần tẩm các khoanh giấy lọc có chứa mẫu thửđều được sấy ở nhiệt độ thấp hơn 60oC đến khô hết dung môi.
Lần 2 thử chất III và chất IV
Mẫu thửđược pha vào dung môi thích hợp (ethanol) với nồng độ 500µg/ml. Các chất đối chiếu cũng được pha vào dung môi thích hợp gồm: Penicillin 20µg/ml, Streptomycin 20µg/ml và fluconazol 500µg/ml.
+ Các khoanh giấy lọc vô trùng và đã được sấy khô được tẩm 3 lần với dung dịch mẫu thử gồm: mẫu chất III và IV, sau mỗi lần tẩm các khoanh giấy lọc có chứa mẫu thửđều được sấy ở nhiệt độ thấp hơn 60oC đến khô hết dung môi.
+ Chuẩn bị môi trường và cấy VSV kiểm định: Với vi khuẩn kiểm định được cấy vào môi trường canh thang, rồi nuôi cấy
cho phát triển trong tủấm 37oC trong thời gian 18-24 giờđến nồng độ 107 tế bào/ml (kiểm tra bằng pha loãng và dãy dịch chuẩn). Môi trường thạch thường vô trùng
(tiệt trùng 118oC/30 phút) được làm lạnh về 45-50oC và được cấy giống VSV kiểm
định vào với tỷ lệ 2,5ml/100ml. Lắc tròn để VSV kiểm định phân tán đều trong môi trường thạch thường, rồi đổ vào đĩa petri vô trùng với thể tích 20ml/đĩa và để cho thạch đông lại.
Với vi nấm: Vi nấm kiểm định (C. albicans) được cấy vào môi trường Sabouraud lỏng, rồi nuôi cấy cho phát triển trong tủ ấm 28-30oC trong 18-24h đến nồng độ 107 tế bào/ml (kiểm tra bằng pha loãng và dãy dịch chuẩn). Đối với MX thì
sử dụng huyền conidi trong dung dịch Tween 80 nồng độ 0,2% vô trùng. Môi trường Sabouraud đặc vô trùng (tiệt trùng ở 118oC/30 phút) được làm lạnh về 45- 50oC và được cấy giống VSV kiểm định vào với tỷ lệ 2,5ml/100ml. Lắc đều để
VSV kiểm định phân tán đều trong môi trường thạch, rồi đổ vào các đĩa petri vô trùng với thể tích 20ml/đĩa và để cho thạch đông lại.
+ Đặt khoanh giấy lọc: Khoanh giấy lọc đã được tẩm chất thử và xử lý như
trên được đặt lên bề mặt môi trường thạch thường chứa VSV kiểm định theo sơ đồ định sẵn.
+ Ủ trong 18-24h, các đĩa petri có mẫu thử được đặt như trên trong tủ ấm ở
toC = 37oC đối với vi khuẩn và toC = 28-30oC đối với vi nấm, rồi sau đó lấy ra đọc kết quả, đo đường kính vòng vô khuẩn hoặc vòng vô nấm nếu có (sử dụng thước kẹp Panmer độ chính xác 0,02mm).
+ Đánh giá kết quả: Dựa trên đường kính vòng vô khuẩn hoặc vòng vô nấm và được đánh giá theo công thức:
2 1 1 ( ) 1 n n i i i i D D D D s n n = = − = = − ∑ ∑
D: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn hoặc vòng vô nấm,
i
D: Đường kính vòng vô khuẩn hoặc vòng vô nấm thứ i, s : Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh,
d. Kết quả thử nghiệm Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm thể hiện ở bảng sau: Lần 1 Bảng 3.14. Kết quả thử tác dụng kháng khuẩn: VK Mẫu
Đường kính vòng vô khuẩn [mm] (D, s)
Bc Bs Bp SL Sal EC Shi Pro Pseu Sta
I - - - - - - - - - - II - - - - - - - - - - III - - - - - - - - - - IV - - - - - - - - - - V - - - - - - - - - - Peni 28,26 0,86 24,42 0,56 12,48 0,28 - 28,42 0,67 Strep 13,73 1,50 11,20 1,05 11,07 0,89 10,53 0,81 12,37 0,67 Với (–) là không có tác dụng kháng khuẩn. Kết luận:
+ Chất I, II, III, IV và chất V không có tác dụng với vi khuẩn.
Bảng 3.15. Kết quả thử tác dụng kháng nấm
Vi nấm Mẫu thử
Đường kính vòng vô khuẩn [mm] ( D , s)
Can MX Chất I - - Chất II - - Chất III - - Chất IV - - Chất V - - Flu - - Với (–) là không có tác dụng kháng nấm
Kết luận:
+ Cả 5 chất I, II, III, IV và V đều không có tác dụng kháng nấm.
Lần 2
Bảng 3.16. Kết quả thử tác dụng kháng khuẩn:
VK Mẫu
Đường kính vòng vô khuẩn [mm] (D, s)
Bc Bs Bp SL Sal EC Shi Pro Pseu Sta
III - - - - - - - - - - IV - - - - - - - - - - Peni 16,77 2,46 20,36 1,51 12,48 0,28 - 18,03 1,74 Strep 10,81 0,91 8,01 0,19 12,01 0,68 18,76 0,70 10,53 0,31 Với (–) là không có tác dụng kháng khuẩn. Kết luận:
+ Chất III và chất IV không có tác dụng với vi khuẩn.
Bảng 3.17. Kết quả thử tác dụng kháng nấm:
Vi nấm Mẫu thử
Đường kính vòng vô khuẩn
[mm] ( D , s) Can MX Chất III - - Chất IV - - Flu - - Với (–) là không có tác dụng kháng nấm. Kết luận: + Cả 2 chất III và IV đều không có tác dụng kháng nấm.
3.7. Bàn luận
3.7.1. Về tổng hợp hóa học
Qua việc tổng hợp 5 chất: I, II, III, IV và V chúng tôi rút ra một số nhận xét như sau:
Chất I: Trên phổ hồng ngoại của sản phẩm phản ứng N-alkyl hóa không có
giải hấp thụ của N-H nguyên liệu succinimid (~3157 cm-1), trong đó xuất hiện các giải hấp thụ đặc trưng của nhân thơm phenyl tại vùng 3036 cm-1 (C-H thơm) và 1600, 1499 cm-1 (C=C thơm). Phổ cũng cho thấy 2 giải hấp thụđặc trưng của chức C=O imid là: 1766 cm-1 (cường độ yếu, dao động cùng pha, νip) và 1696 cm-1 (cường độ mạnh nhất, dao động lệch pha, νop). Ngoài ra các C=O này phối hợp với nhau tạo ra một dao động đặc trưng nữa cho imid tại vùng 3433 cm-1. Liên kết CH2- N hình thành sau phản ứng N-alkyl hóa có dao động tại 1164 cm-1. Các nhóm CH2 (no) cho số sóng đặc trưng tại 2951 cm-1.
Chất II: Trên phổ hồng ngoại của sản phẩm phản ứng N-alkyl hóa không có
giải hấp thụ của N-H nguyên liệu phthalimid (3201 cm-1), trong đó xuất hiện các giải hấp thụ đặc trưng của nhân thơm phenyl tại vùng 3057 cm-1 (C-H thơm) và 1611, 1500 cm-1 (C=C thơm). Phổ cũng cho thấy 2 giải hấp thụđặc trưng của chức C=O imid là: 1770 cm-1 (cường độ yếu, dao động cùng pha) và 1702 cm-1 (cường
độ mạnh nhất, dao động lệch pha). Liên kết CH2-N hình thành sau phản ứng N-alkyl
hóa có dao động tại 1175 cm-1. Nhóm CH2 (no) cho số sóng đặc trưng tại 2915 cm-1.
Chất III: Trên phổ hồng ngoại của sản phẩm phản ứng diacyl hóa (ngưng tụ) xuất hiện các giải hấp thụ đặc trưng của chức C=O imid là: 1769 cm-1 (cường độ
yếu, dao động cùng pha) và 1696 cm-1 (cường độ mạnh nhất, dao động lệch pha). O-H phenol dạng tự do cho đỉnh hấp thụ đặc trưng tại 3565 cm-1. Mặt khác nhóm OH này có thể tồn tại dạng liên kết hydro liên phân tử, nên cho có vùng hấp thụđặc trưng tại 3401, 3360 cm-1. Vùng này cũng đặc trưng cho liên kết O-H acid trong cấu trúc của sản phẩm. Liên kết (CH)-N hình thành sau phản ứng có dao động tại 1175cm-1. Các C-H (no) cho số sóng đặc trưng tại 2924 và 2860 cm-1. Các nhân
thơm cho các giải hấp thụ xung quanh vùng 3070 cm-1 (C- H thơm) và 1615, 1516 cm-1 (C=C thơm). C=O acid có đỉnh hấp thụ tại 1720 cm-1.
Chất IV: Trên phổ hồng ngoại của sản phẩm phản ứng diacyl hóa (ngưng tụ) xuất hiện các giải hấp thụ đặc trưng của chức C=O imid là: 1775 cm-1 (cường độ yếu, dao động cùng pha) và 1702 cm-1 (cường độ mạnh nhất, dao động lệch pha). Liên kết N=O của nhóm nitro thơm cho giải hấp thụ đặc trưng với cường độ trung bình tại 1536, 1324 và 1305 cm-1. Sự có mặt đồng thời của nhóm nitro này và nhóm OH phenol ở vị trí ortho tạo ra liên kết hydro nội phân tử. Ngoài ra, giữa các nhóm OH có thể tồn tại liên kết hydro liên phân tử. Chính vì thế O-H phenol cho giải hấp thụ đặc trưng tại vùng số sóng là 3282 cm-1 - thấp hơn thông thường. Đồng thời vùng này cũng đặc trưng cho chức O-H acid của sản phẩm (dạng dimer). Liên kết (CH)-N hình thành sau phản ứng có dao động tại 1170 cm-1. Các C-H (no) cho số sóng đặc trưng tại 2934 (dao động bất đối xứng) và 2855 cm-1 (dao động đối xứng). Các nhân thơm cho các giải xung quanh vùng 3041 cm-1 (C-H thơm) và 1629, 1500 cm-1 (C=C thơm). C=O acid có đỉnh hấp thụ tại 1720 cm-1.
Chất V: Trên phổ hồng ngoại của sản phẩm phản ứng diacyl hóa (ngưng tụ) xuất hiện các giải hấp thụ đặc trưng của chức C=O imid là: 1775 cm-1 (cường độ yếu, dao động cùng pha) và 1701 cm-1 (cường độ mạnh nhất, dao động lệch pha). Liên kết N=O của 2 nhóm nitro thơm cho giải hấp thụđặc trưng với cường độ trung bình tại 1533, 1360 và 1305 cm-1. Sự có mặt đồng thời của nhóm nitro thơm và nhóm OH phenol ở vị trí ortho tạo ra liên kết hydro nội phân tử. Ngoài ra, giữa các nhóm OH có thể tồn tại liên kết hydro liên phân tử. Chính vì thế O-H phenol cho giải hấp thụđặc trưng tại vùng số sóng là 3458 và 3275 cm-1. Đồng thời vùng này cũng đặc trưng cho chức O-H acid của sản phẩm (dạng dimer). Liên kết (CH)-N hình thành sau phản ứng có dao động tại 1170 cm-1. Các C-H (no) cho số sóng đặc trưng tại 2924 và 2850 cm-1. Các nhân thơm cho các giải xung quanh vùng 3041 cm-1 (C-H thơm) và 1629, 1500 cm-1 (C=C thơm). C=O acid có đỉnh hấp thụ tại 1720 cm-1.
Chất I: Trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của sản phẩm xuất hiện các tín hiệu đặc trưng của nhân thơm tại vùng trường yếu 7,24-7,32 ppm. Khung
succinimid cho duy nhất 1 tín hiệu singlet tại 2,68 ppm do tính tương đương từ của các proton CH2 trong khung. Proton của nhóm N-CH2 cho tín hiệu singlet tại 4,53 ppm do cacbon liên kết với nitơ và nhân thơm. Tín hiệu do dung môi DMSO xuất hiện ở 2,50 ppm. Trên phổ còn quan sát thấy tín hiệu của tạp nước trong DMSO với
độ chuyển dịch hóa học là 3,34-3,38 ppm.
Chất II: Trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của sản phẩm xuất hiện các tín hiệu đặc trưng của 2 nhân thơm: phenyl (7,26-7,34 ppm) và phenylen (7,82- 7,90 ppm). Tín hiệu có độ chuyển dịch hóa học lớn hơn cả (7,87-7,90 ppm) thuộc về các proton H-4 và H-7 do ảnh hưởng của 2 nhóm C=O imid ở vị trí ortho. Proton
của nhóm N-CH2 cho tín hiệu singlet tại 4,77 ppm do cacbon liên kết với nitơ và nhân thơm. Tín hiệu do dung môi DMSO xuất hiện ở 2,50 ppm. Trên phổ còn quan sát thấy tín hiệu của tạp nước trong DMSO với độ chuyển dịch hóa học là 3,32-3,34 ppm.
Chất III: Trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của sản phẩm xuất hiện các tín hiệu đặc trưng của mảnh L-tyrsin. Trong đó, quan sát thấy rõ rệt sự tương tác