3.7.1.1. Khảo sát phương pháp phân tích
Tiến hành như đã trình bày ở mục 2.3.4.3. Kết quả thu được như sau:
Ion con và ion phân tử
Bảng 3.19. Các ion phân tử và ion con trong phân tích khối phổ
Tên chất phân tích Mảnh mẹ (m/z) Mảnh con (m/z) CE (eV) Ghi chú Rotundin 356 165 31 Định lượng 176 50 Định tính Berberin 336 321 25 Định lượng 306 25 Định tính
Các thông số kỹ thuật khác của khối phổ được trình bày trong bảng PL3.
Sau khi lựa chọn được ion phân tử, ion con và các điều kiện tối ưu, tiến hành phân tích dung dịch rotundin và berberin chuẩn có nồng độ 100 ng/ml. Sắc ký đồ được trình bày ở hình PL8. Pic thu được cân đối, nhọn, không có hiện tượng dính pic. Vậy điều kiện phân tích là phù hợp để tiến hành định lượng rotundin trong huyết tương.
3.7.1.2. Thẩm định phương pháp phân tích LC-MS/MS
a.Tính đặc hiệu
Để đánh giá tính đặc hiệu, tiến hành phân tích các mẫu huyết tương trắng, mẫu huyết tương trắng thêm chuẩn, mẫu huyết tương trắng thêm nội chuẩn, mẫu chuẩn rotundin và mẫu chuẩn nội chuẩn trong methanol. Hình PL9 giới thiệu sắc đồ của các mẫu trên. Từ sắc ký đồ ta có thể thấy, thời gian lưu của rotundin và berberin trên nền huyết tương thêm chuẩn và nội chuẩn hoàn toàn giống với trên mẫu chuẩn, không xuất hiện pic ở mẫu huyết tương trắng ở khoảng thời gian lưu của các pic nói trên. Từ kết quả trên cho thấy, phương pháp xây dựng đáp ứng tiêu chuẩn về tính đặc hiệu.
b.Giới hạn định lượng (LOQ)
LOQ được xác định thông qua đánh giá tỷ số tín hiệu trên nhiễu (S/N). LOQ được xác định tại nồng độ thu được S/N khoảng bằng 10. Phân tích các mẫu trắng thêm chuẩn ở các nồng độ 0,5 ng/ml, 1 ng/ml, 2 ng/ml, ta thấy ở nồng độ 1 ng/ml có tỷ số S/N = 10,45. Vậy 1 ng/ml là dưới hạn định lượng dưới của phương pháp phân tích. Sắc ký đồ của mẫu trắng thêm rotundin chuẩn 1 ng/ml được trình bày ở hình PL10.
c.Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
Để xác định khoảng tuyến tính chúng tôi thực hiện phân tích dãy dung dịch chuẩn với nồng độ thay đổi từ 5 ng/ml đến 200 ng/ml có thêm 50 ng/ml nội chuẩn và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ. Đường chuẩn được pha trên nền huyết tương trắng để loại trừ ảnh hưởng nền. Kết quả: y = 0,0246x + 0,0698 (R² = 0,9989). Đường chuẩn và kết quả cụ thể được trình bày ở hình PL11 và bảng PL11.
Đường tuyến tính có hệ số tương quan: R2 > 0,99 do đó trong khoảng nồng độ đã khảo sát có sự phụ thuộc tuyến tính giữa tỷ số diện tích pic chuẩn trên nội chuẩn và nồng độ rotundin tương ứng.
d.Độ lặp lại và độ thu hồi
Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp được đánh giá bằng cách phân tích các mẫu trắng thêm chuẩn 50 ng/ml và nội chuẩn 50 ng/ml (IS), phân tích lặp lại 6 lần. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.20. Pic sắc ký thể hiện ở hình PL12.
Bảng 3.20. Kết quả thẩm định độ lặp lại và độ thu hồi
Mẫu Srotundin Sberberin Srotundin/Sberberin Nồng độ
1 7560000 6040000 1,251 48,043 2 6930000 5710000 1,214 46,498 3 3540000 3350000 1,057 40,118 4 6640000 5210000 1,274 48,971 5 4550000 4590000 0,991 37,459 6 3420000 3160000 1,082 41,158 TB 43,708 Độ thu hồi 87,42% RSD % 10,862%
Nhận xét kết quả phân tích cho độ thu hồi đạt 87,42%, độ lệch chuẩn tương đối RSD = 10,862%. Vậy theo tiêu chuẩn FDA, phương pháp phân tích đã đạt yêu cầu về tiêu chuẩn độ đúng, độ lặp lại.
3.7.2. Đánh giá sinh khả dụng và các thông số dược động học
Hiện nay trên thế giới, các tài liệu nghiên cứu về rotundin còn ít. Do đó, những hiểu biết về đặc tính dược động học của dược chất này còn nhiều hạn chế. Vì vậy, để hiểu hơn về dược động học của dược chất và chứng minh khả năng tăng sinh khả dụng của hệ TVNH và pellet chứa hệ TVNH so với nguyên liệu. Chúng tôi tiến hành đánh giá sinh khả dụng đường uống của 3 dạng sau: hệ TVNH, pellet chứa hệ TVNH và
nguyên liệu trên mô hình thỏ với mô hình động học không ngăn. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.21 như sau:
Bảng 3.21. Thông số dược động học đánh giá SKD trên thỏ
Thỏ
Nguyên liệu Hệ TVNH Pellet chứa hệ TVNH
Tmax (phút) Cmax (ng/ml) AUC (ng.h/ml) Tmax (phút) Cmax (ng/ml) AUC (ng.h/ml) Tmax (phút) Cmax (ng/ml) AUC (ng.h/ml) 1 15 54,167 31,618 5 154,028 89,016 5 107,923 81,133 2 15 33,301 36,679 5 80,132 69,073 5 87,819 34,931 3 15 57,193 36,378 5 105,946 51,571 5 94,521 53,361 TB 15 48,220 34,892 5 113,369 69,886 5 96,754 56,475 SD 0 13,008 2,838 0 37,503 18,735 0 10,236 23,257 SKD tương đối(%) 200,297 161,859 Chú thích : AUC(0-24h)
Hình 3.7. Nồng độ rotundin trong huyết tương thỏ của hệ TVNH và pellet chứa hệ TVNH theo thời gian -20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 -50 0 50 100 150 200 250 300 SMEDDS Pellet-SMEDDS thời gian (phút) Nộng độ RTD (ng/ml)
Hình 3.8. Nồng độ rotundin trong huyết tương thỏ của pellet chứa hệ TVNH và nguyên liệu theo thời gian
Từ bảng 3.21, hình 3.7 và hình 3.8 có thể thấy:
Chỉ số AUC(0-24h) của hệ TVNH và pellet chứa hệ TVNH so với nguyên liệu lần lượt đạt 200,297 % và 161,859 %, đồng thời C max của hệ TVNH và pellet chứa hệ TVNH lần lượt gấp 2,35 và 2,00 lần so với C max của nguyên liệu. Điều này cho thấy, mức độ hấp thu của hệ TVNH và pellet chứa hệ TVNH cao hơn rất đáng kể so với nguyên liệu.
Chỉ số Tmax cho thấy tốc độ hấp thu của hệ TVNH và pellet chứa hệ TVNH đều nhanh hơn nguyên liệu.
Vậy hệ TVNH và pellet chứa hệ TVNH cải thiên cả mức độ và tốc độ hấp thu rotundin, từ đó nâng cao SKD đường uống so với nguyên liệu. Khả năng cải thiện SKD do một số nguyên nhân sau: hệ TVNH và pellet chứa hệ TVNH tạo ra giọt vi nhũ
-20 0 20 40 60 80 100 120 -50 0 50 100 150 200 250 300 Nguyên liêu Pellet-SMEDDS Nộng độ RTD (ng/ml) thời gian (phút)
tương có KTTP nhỏ, phân bố kích thước hẹp làm tăng diện tích tiếp xúc của thuốc với niêm mạc ruột, cộng với các thành phần chất diện hoạt, lipid có tác động tới quá trình vận chuyển thuốc qua tế bào biểu mô đường ruột, ngoài ra trong pellet chứa hệ TVNH rotundin tồn tại ở trạng thái vô định hình vì vậy độ tan cao hơn trạng thái kết tinh của rotundin trong nguyên liệu.
Ngoài ra, hệ TVNH và pellet chứa hệ TVNH có ít sự khác nhau về AUC(0-24h),
Tmax và Cmax. Vậy việc rắn hóa hệ TVNH lỏng bằng pellet vừa khắc phục được nhược điểm của hệ TVNH khi tồn tại ở dạng lỏng vừa khai thác được ưu điểm của dạng bào chế pellet mà ít gây ảnh hưởng tới SKD của hệ TVNH.
Mặt khác thí nghiệm đánh giá SKD cho thấy, dược chất rotundin hấp thu nhanh (Tmax ngắn) và thời gian thải trừ nhanh (sau 4 giờ uống nồng độ thuốc trong huyết tương còn 0 ng/ml). Vậy rotundin là một dược chất khó tan trong nước nhưng khả năng thấm tốt và bị thải trừ nhanh. Đặc điểm này của rotundin là do RTD có tính thân dầu cao, minh chứng là RTD qua được hàng rào máu não và gắn trên các receptor GABA, α- adrenergic, receptor D qua đó có tác dụng giảm dẫn truyền thần kinh, an thần gây ngủ.
Từ kết quả đánh giá SKD có thể kết luận rằng pellet chứa hệ TVNH duy trì được sinh khả dụng tương đương hệ TVNH lỏng. Điều đó cho thấy, việc rắn hóa hệ TVNH lỏng bằng phương pháp đùn tạo cầu là phù hợp, có khả năng ứng dụng trong thực tế. Điều này cũng đã được chứng minh bằng các nghiên cứu trên thế giới trước đó [19], [40].
4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
Kết luận
Sau khi thực hiện đề tài “Nghiên cứu bào chế pellet chứa hệ tự vi nhũ hóa rotundin” kết quả thu được như sau:
Đã lựa chọn được các thông số quy trình và thành phần công thức phù hợp để bào chế pellet chứa hệ TVNH bằng phương pháp đùn tạo cầu. Kết quả cụ thể đã được trình bày ở phần kết quả.
Đánh giá được hiệu suất tạo pellet tăng khi lượng Avicel PH101. Hiệu quả hòa tan và phần trăm giải phóng rotundin sau 10 phút tăng khi lượng Aerosil 200 giảm. Từ đó, lựa chọn được công thức pellet phù hợp có hàm lượng hệ TVNH, Avicel PH101, Aerosil 200, lactose monohydrat, natri croscarmellose lần lượt là: 35%, 50%, 0%, 5%, 10% và PVP K30 5% vừa đủ.
Pellet phù hợp được đánh giá trên các chỉ tiêu và cho kết quả như sau: có hình dạng cầu, bề mặt nhẵn và có lỗ xốp ( chụp SEM), chứa rotundin ở trạng thái vô định hình (đo X-ray), kích thước giọt vi nhũ tương 42,087 nm không khác nhiều so với hệ TVNH lỏng (33,265 nm).
Khảo sát và thẩm định được phương pháp LC-MS/MS định lượng rotundin trong huyết tương với kết quả thẩm đinh như sau: LOQ 1ng/ml, khoảng tuyến tính từ 5 ng/ml-200ng/ml, RSD= 10,862%, độ thu hồi đạt 87,42%
Tiến hành đánh giá sinh khả dụng cho thấy, pellet chứa hệ TVNH có sinh khả dụng tương đối đạt 161,859% so với nguyên liệu và không khác nhiều so với hệ TVNH lỏng.
Đề xuất
Nâng cao hiệu suất nạp dược chất vào pellet. Đánh giá SKD trên mô hình khác với quy mô lớn hơn. Nghiên cứu độ ổn định của pellet chứa hệ TNV.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học, tr. 696-697.
2. Bộ Y tế (2007), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm, NXB Y học, Hà Nộ, tr. 228-229. 3. Nguyễn Đăng Hòa (2005), "Kỹ thuật bào chế pellet", Một số chuyên đề về bào
chế hiện đại, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr. 56-92.
4. Nguyễn Trần Linh (2012), Một số phương pháp thiết kế thí nghiệm và tối ưu
hóa ứng dụng trong bào chế, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr. 5-11.
5. Viện dược liệu (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội.
Tài liệu tiếng anh
6. Abbaspour M., Jalayer N., Sharif M. B. (2014), "Development and Evaluation of a Solid Self-Nanoemulsifying Drug Delivery System for Loratadin by Extrusion-Spheronization", Advanced Pharmaceutical Bulletin, 4(2), pp. 113- 119.
7. Abdalla A., Klein S., Mäder K. (2008), "A new self-emulsifying drug delivery system (SEDDS) for poorly soluble drugs: Characterization, dissolution, in vitro digestion and incorporation into solid pellets", European Journal of Pharmaceutical Sciences, 35(5), pp. 457-464.
8. Abdalla A., Mäder K. (2007), "Preparation and characterization of a self- emulsifying pellet formulation", European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 66(2), pp. 220-226.
9. Anastassiades M. et al (2003), "Fast and Easy Multiresidue Method Employing Acetonitrile Extraction/Partitioning and “Dispersive Solid-Phase Extraction” for the Determination of Pesticide Residues in Produce",
Journal of AOAC International, 86(2), pp. 412-431.
10. Anzillotti L., Odoardi S., Strano-Rossi S. (2014), "Cleaning up blood samples using a modified “QuEChERS” procedure for the determination of drugs of
abuse and benzodiazepines by UPLC–MSMS☆", Forensic Science International, 243(0), pp. 99-106.
11. BG P., MM P. (2007), "Conventional and alternative pharmaceutical methods to improve oral bioavailability of lipophilic drugs", Asian J. Pharm, pp. 8.
12. Bogusz M. J. (2000), "Liquid chromatography–mass spectrometry as a routine method in forensic sciences: a proof of maturity", Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications, 748(1), pp. 3-19.
13. Boltri L. et al (1997), "Enhancement and Modification of Etoposide Release from Crospovidone Particles Loaded with Oil-Surfactant Blends",
Pharmaceutical Development and Technology, 2(4), pp. 373-381.
14. Chao-Wu L. et al (2011), "Determination of l-tetrahydropalmatine in human plasma by HPLC and pharmacokinetics of its disintegrating tablets in healthy Chinese", European Journal of Drug Metabolism and Pharmacokinetics, 36(4), pp. 257-262.
15. Chen M. et al (2001), "Bioavailability and Bioequivalence: An FDA Regulatory Overview", Pharmaceutical Research, 18(12), pp. 1645-1650.
16. Christensen K. L., Pedersen G. P., Kristensen H. G. (2001), "Preparation of redispersible dry emulsions by spray drying", International Journal of Pharmaceutics, 212(2), pp. 187-194.
17. Deng Y. et al (2008), "Simultaneous determination of berberine, palmatine and jatrorrhizine by liquid chromatography–tandem mass spectrometry in rat plasma and its application in a pharmacokinetic study after oral administration of coptis–evodia herb couple", Journal of Chromatography B, 863(2), pp. 195-205. 18. Hansen T., Holm P., Schultz K. (2004), "Process characteristics and compaction of spray-dried emulsions containing a drug dissolved in lipid", International Journal of Pharmaceutics, 287(1–2), pp. 55-66.
19. Hu X. et al (2012), "Sirolimus solid self-microemulsifying pellets: Formulation development, characterization and bioavailability evaluation", International Journal of Pharmaceutics, 438(1–2), pp. 123-133.
20. Ito Y. et al (2005), "Oral solid gentamicin preparation using emulsifier and adsorbent", Journal of Controlled Release, 105(1–2), pp. 23-31.
21. Jannin V., Musakhanian J., Marchaud D. (2008), "Approaches for the development of solid and semi-solid lipid-based formulations, in Advanced Drug Delivery Reviews. p. 734-746.
22. Kang J. H. et al (2012), "Effects of solid carriers on the crystalline properties, dissolution and bioavailability of flurbiprofen in solid self-nanoemulsifying drug delivery system (solid SNEDDS)", European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 80(2), pp. 289-297.
23. Kim D. W. et al (2012), "Development of novel flurbiprofen-loaded solid self- microemulsifying drug delivery system using gelatin as solid carrier", Journal of Microencapsulation, 29(4), pp. 323-330.
24. Kommuru T. R. et al (2001), "Self-emulsifying drug delivery systems (SEDDS) of coenzyme Q10: formulation development and bioavailability assessment",
International Journal of Pharmaceutics, 212(2), pp. 233-246.
25. Liu X. et al (2012), "Responses of dopaminergic, serotonergic and noradrenergic networks to acute levo-tetrahydropalmatine administration in naïve rats detected at 9.4 T", Magnetic resonance imaging, 30(2), pp. 261-270. 26. Ma H., (2009), "Simultaneous determination of tetrahydropalmatine, protopine,
and palmatine in rat plasma by LC-ESI-MS and its application to a pharmacokinetic study", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 49(2), pp. 440-446.
27. Mantsch J. R. et al (2007), "Levo-tetrahydropalmatine attenuates cocaine self- administration and cocaine-induced reinstatement in rats",
Psychopharmacology, 192(4), pp. 581-591.
28. Matsaridou I. et al (2012), "The Influence of Surfactant HLB and Oil/Surfactant Ratio on the Formation and Properties of Self-emulsifying Pellets and Microemulsion Reconstitution", AAPS PharmSciTech, 13(4), pp. 1319-1330.
29. Mueller E. A. et al (1994), "Improved dose linearity of cyclosporine pharmacokinetics from a microemulsion formulation", Pharmaceutical research, 11(2), pp. 301-304.
30. Patil P., Joshi P., Paradkar A. (2004), "Effect of formulation variables on preparation and evaluation of gelled self-emulsifying drug delivery system (SEDDS) of ketoprofen", AAPS PharmSciTech, 5(3), pp. 43-50.
31. Ritschel W. A. (1987), "In vivo animal models for bioavailability assessment",
STP pharma, 3(2), pp. 125-141.
32. Sander C., Holm P. (2009), "Porous Magnesium Aluminometasilicate Tablets as Carrier of a Cyclosporine Self-Emulsifying Formulation", AAPS PharmSciTech, 10(4), pp. 1388-1395.
33. Sauve E. N. et al (2012), "Determination of benzodiazepines in ante-mortem and post-mortem whole blood by solid-supported liquid–liquid extraction and UPLC–MS/MS", Journal of Chromatography B, 883–884(0), pp. 177-188. 34. Schenck F. J. et al (2002), "Comparison of Magnesium Sulfate and Sodium
Sulfate for Removal of Water from Pesticide Extracts of Foods", Journal of AOAC International, 85(5), pp. 1177-1180.
35. Setthacheewakul S. et al 2010), "Development and evaluation of self- microemulsifying liquid and pellet formulations of curcumin, and absorption studies in rats", European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 76(3), pp. 475-485.
36. Tan A., Rao S., Prestidge C. (2013), "Transforming Lipid-Based Oral Drug Delivery Systems into Solid Dosage Forms: An Overview of Solid Carriers, Physicochemical Properties, and Biopharmaceutical Performance",
Pharmaceutical Research, 30(12), pp. 2993-3017.
37. Tang B. et al (2008), "Development of solid self-emulsifying drug delivery systems: preparation techniques and dosage forms", Drug Discovery Today, 13(13–14), pp. 606-612.
38. Usui K. et al (2012), "Rapid drug extraction from human whole blood using a modified QuEChERS extraction method", Legal Medicine, 14(6), pp. 286-296.
39. Vervaet C., Baert L., Remon J. P. (1995), "Extrusion-spheronisation A literature review", International Journal of Pharmaceutics, 116(2), pp. 131-146.
40. Wang Z. et al (2010), "Solid self-emulsifying nitrendipine pellets: Preparation and in vitro/in vivo evaluation", International Journal of Pharmaceutics, 383(1– 2), pp. 1-6.
41. Welling P. (1991), Pharmaceutical bioequivalence, Informa Health Care, pp. 1- 34.
42. Yue K. et al (2014), "L-Stepholidine, a naturally occurring dopamine D1 receptor agonist and D2 receptor antagonist, attenuates heroin self-