2.3.4.1. Thiết kế mô hình đánh giá sinh khả dụng
Chuẩn bị động vật thí nghiệm: 9 con thỏ trưởng thành có trọng lượng 2 - 3 kg được nuôi trong phòng dược lý đại học Dược Hà Nội. Cho thỏ nhịn ăn và uống trong vòng 24 h trước khi tiến hành thí nghiệm.
Chuẩn bị mẫu thuốc: pellet chứa hệ TVNH và hệ TVNH dạng lỏng được phân tán đồng nhất trong môi trường nước. Nguyên liệu rotundin được phân tán dưới dạng hỗn dịch trong dung dịch NaCMC 0,5%.
Mô hình đánh giá SKD: 9 con thỏ sẽ được chia là 3 nhóm ( mỗi nhóm 3 con) - Nhóm 1: cho uống dạng nguyên liệu ở mức liều 3 mg rotundin /con.
- Nhóm 2: cho uống một lượng chính xác hệ TVNH dạng lỏng tương đương 3mg rotundin/con.
- Nhóm 3: cho uống một lượng chính xác pellet chứa hệ TVNH tương đương 3 mg rotundin/con.
Lấy mẫu và xử lý huyết tương: Sau khi cho thỏ uống mẫu thuốc 5 phút, 15 phút, 30 phút, 1 giờ, 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 24 giờ tiến hành hút 2 ml máu thỏ cho
vào ống có tráng heparin. Ly tâm mẫu máu ở v=6000 vòng/phút trong 10 phút. Thu huyết tương, bảo quản ở nhiệt độ -10ºC trước khi đưa đi phân tích LC-MS/MS.
2.3.4.2. Phương pháp chiết QuEChERS
Tham khảo phương pháp chiết QuEChERS trong tài liệu [9] với quy trình như sau: hút chính xác 0,5 ml huyết tương cho vào ống ly tâm 2ml. Thêm 25 µl dung dịch berberin 1 µg/ml và 0,5 ml acetonitril. Tiến hành lắc xoáy trong vòng 1 phút để tạo hỗn hợp đồng nhất. Tiếp tục thêm 0,2 g MgSO4 và 0,05 g NaCl. Lắc xoáy trong vòng 1 phút sau đó ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút trong vòng 10 phút. Hút lớp dịch lỏng trên cùng đưa đi định lượng bằng phương pháp LC-MS/MS.
2.3.4.3. Phương pháp phân tích rotuntin trong huyết tương bằng kỹ thuật LC-MS/MS
a. Khảo sát phương pháp phân tích
Để tối ưu hóa điều kiên phân tích, tiến hành tiêm trực tiếp dung dịch chuẩn rotundin và berberin ở nồng độ 100 ng/ml vào MS với nguồn ESI, chế độ ion dương. Ion phân tử được lựa chọn dựa vào khối lượng phân tử, thường có dạng [M-H]+. Chọn chế độ khảo sát tự động để bắn phá ion phân tử thành các ion con, lựa chọn ion con có cường độ cao nhất để định lượng và ion có cường độ thấp hơn để xác nhận. Tối ưu hóa năng lượng bắn phá (CE) tự động theo phần mềm của thiết bị.
b. Thẩm định phương pháp phân tích
Quy trình thẩm định phương pháp định lượng được tiến hành theo hướng dẫn của FDA. Gồm các chỉ tiêu thẩm định sau: tính chọn lọc, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, khoảng tuyến tính và đường chuẩn, độ lặp lại và độ thu hồi.
c. Tiến hành định lượng rotundin trong huyết tương bằng LC-MS/MS
Sau khi khảo sát và thẩm định phương pháp phân tích, tiến hành định lượng RTD trong huyết tương như sau:
Sử dụng phương pháp thêm nội chuẩn (IS): berberin.
Tiến hành định lượng bằng phương pháp LC-MS/MS với các điều kiện HPLC như sau:
- Cột sắc ký: C18 (150 mm × 4,6 mm × 5 μm) và tiền cột C18 của Waters.
- Pha động gồm có acetonitril và dd amoniaceat 5mM với chương trình gradien nồng độ như sau: từ phút thứ 0 đến phút thứ 1 acetonitril chiếm 50%. Từ phút thứ 1 đến phút thứ 2 lượng acetonitril tăng từ 50 lến 100%. Lượng acetonitril này được duy trì từ phút thứ 2 đến phút thứ 6. Từ phút từ 6 tới phút 7,5 lượng acetonitril giảm từ 100 % xuống 50% và được duy trì tới khi chu kỳ kết thúc.
- Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút. - Thể tích tiêm:5 µl.