CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng chế từ kháng nguyên tái tổ hợp
* Phương pháp lấy mẫu huyết thanh trâu để chẩn đoán bệnh
Lấy mẫu máu trâu cần kiểm tra cho vào ống nghiệm, để nghiêng ống nghiệm sao cho diện tích bề mặt máu rộng tối đa. Cố định ống nghiệm cho đến khi máu đông, dựng thẳng ống nghiệm lên để ở nhiệt độ thường hoặc trong tủ ấm 37ºC, khi thấy ra nhiều huyết thanh thì bỏ ống nghiệm vào tủ lạnh ở nhiệt độ 4 - 6ºC trong 2 - 3 tiếng để máu co lại và chắt lấy huyết thanh. Sau khi chắt được huyết thanh, lấy huyết thanh li tâm 1000 vòng/phút để loại bỏ hồng cầu. Bảo quản huyết thanh ở - 20ºC.
* Phương pháp sử dùng KIT CATT
- Bước 1: Chuyển KIT về nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.
- Bước 2: Dùng micropipet lấy 0,5 ml dung dịch pha loãng huyết thanh vào ống eppendorf.
- Bước 3: Lấy 0,1 ml huyết thanh cần chẩn đoán trộn đều vào ống eppendorf có chứa dung dịch pha loãng huyết thanh.
- Bước 4: Nhỏ lên các ô tròn trên card phản ứng, mỗi ô (10 µ l) kháng nguyên.
- Bước 5: Nhỏ các mẫu huyết thanh cần chẩn đoán (đã chuẩn bị ở bước 3), huyết thanh dương tính chuẩn, huyết thanh âm tính chuẩn vào các ô đã gắn kháng nguyên.
- Bước 6: Dùng que khuấy, trộn đều kháng nguyên và kháng thể. Sau (3 – 5 phút) đọc kết quả dựa trên sự hình thành đám ngưng kết:
+ Có hiện tượng ngưng kết: Dương tính (+) + Không có hiện tượng ngưng kết: Âm tính (-)
* Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của KIT
Các mẫu huyết thanh dương tính và âm tính với TMT của trâu được sử dụng để thực hiện xác định độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của KIT.
+ Độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng được xác định theo bảng và công thức dưới đây:
Kết quả Nhiễm TMT Không nhiễm TMT Tổng số
Xét nghiệm (+) A b a + b
Xét nghiệm (-) C d c + d
Tổng số a + c b + d N
Công thức tính độ nhạy, độ đặc hiệu như sau: Độ nhạy của phản ứng (Se) = a/a + c
Độ đặc hiệu của phản ứng (Sp) = d/b + d
+ Độ ổn định của KIT được xác định trên 10 mẫu huyết thanh được lấy ngẫu nhiên, kháng thể đặc hiệu với TMT trong các mẫu huyết thanh này được xác định bằng KIT chế tạo với cùng các điều kiện thực hiện. Lặp lại phản ứng 5 lần. Chấm điểm ngưng kết của tất cả các lần phản ứng, xác định hệ số biến động (coefficient of variation - CV). Hệ số biến động càng nhỏ thì độ ổn định của KIT càng cao.
Dưới đây là bảng chấm điểm ngưng kết giữa kháng nguyên và kháng thể trên bảng CATT chế từ kháng nguyên tái tổ hợp dựa trên thang điểm từ âm tính (-), nghi ngờ (+/-) và 1+, 4+ (hình 4.2).
Hình 3.1: Đánh giá kết quả sử dụng KIT CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng
Mẫu âm tính: được chấm từ 0 đến 49 điểm tùy thuộc vào mức độ xuất hiện các chấm ngưng kết.
Mẫu nghi ngờ: quy ước là 50 điểm.
Mẫu dương tính: 1+ (60 điểm), 2+ (70 điểm), 3+ (80 điểm), 4+ (90 đến 100 điểm).
3.4.2. Phương pháp xác định điều kiện bảo quản KIT theo nguyên lý CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2