2.1.2.1. Kháng nguyên RoTAT 1.2 của Trypanosoma evansi
Kháng nguyên RoTAT 1.2 có bản chất là glycoprotein bề mặt của tiên mao trùng. Theo Bajyana Songa và Hamers (1988) [32], kháng nguyên RoTAT 1.2 là kháng nguyên bề mặt chính của T.evansi, nó xuất hiện sớm ngay sau khi ký sinh trùng xuất hiện đồng thời không gây phản ứng chéo với kháng thể đặc hiệu của các loài ký sinh trùng khác, kháng nguyên này có mặt ở hầu hết các VAT (variable antigen type) của Trypanosoma evansi. Hơn nữa, các tác giả này cũng chứng minh rằng RoTAT 1.2 là kháng nguyên đại diện của T.evansi dựa trên cơ sở chỉ có các mẫu huyết thanh của gia súc gây nhiễm với T.evansi mới nhận biết được kháng nguyên RoTAT 1.2, trong khi đó tất cả các mẫu huyết thanh của gia súc được gây nhiễm bởi
T.brucei đều không nhận biết được kháng nguyên này. Vì vậy, công tác nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp ứng dụng để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng bằng cách khuếch đại gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2.
2.1.2.2. Tách dòng gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của Trypanosoma evansi
Tách dòng gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 được thực hiện bằng cách gắn trực tiếp sản phẩm PCR đã được xử lý cắt đầu bằng vector tách dòng pJET1.2/blunt của hãng Fermentas. Phản ứng dựa vào đặc tính xúc tác hình thành
liên kết nối hai đoạn ADN của enzym T4 ADN - ligase. Enzym này có nguồn gốc từ phage T4 xâm nhiễm E.coli, có khả năng nối hai trình tự ADN cả đầu so le và đầu bằng. Phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ 22ºC trong thời gian 10 phút. Đây là nhiệt độ thích hợp nhất cho enzym ADN T4 ligase hoạt động.
Vector tách dòng pJET1.2/blunt được tách chiết từ dòng tế bào E.coli DH5α/pJET1.2/blunt và được cắt mở vòng bằng enzym Klenow. Đây là vector tách dòng thế hệ mới của hãng Fermentas có kích thước gần 3kb (2974bp). Trên vector có gắn gen kháng sinh (bla) nên chỉ có những tế bào có mang vector này mới có thể sống được trên môi trường có ampicilin. Đồng thời trên vector này có chứa gen gây chết eco47IR mã hóa cho nuclease phân hủy ADN nhân khi tồn tại trong tế bào vật chủ. Vì vậy, vector khi được gắn thêm gen ngoại lai sẽ làm mất đi hoại tính của enzym này dẫn đến sự không phân hủy ADN của tế bào chủ. Nhờ có eco471IR mà quá trình chọn lọc plasmid tái tổ hợp sẽ hiệu quả hơn.
Gen RoTAT 1.2 được thu nhận sản phẩm PCR có kích thước khoảng 205bp. Việc sử dụng enzym Taq polymerase để xúc tác cho phản ứng PCR sẽ tạo ra các sản phẩm có gắn thêm một adenin ở đầu 3'.Gen RoTAT 1.2 được nối vào plasmid pJET1.2/blunt đã được mở vòng rồi được biến nạp vào tế bào
E.coli chủng DH10b. Nhờ bộ máy tổng hợp của vi khuẩn, ADN plasmid tái tổ hợp được tạo ra với số lượng lớn các bản sao. Quá trình biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến được thực hiện bằng phương pháp sốc nhiệt. Vector pJET1.2/blunt có chứa gen mã hóa kháng kháng sinh ampicilin cho phép dễ dàng phát hiện vector tái tổ hợp một cách đơn giản bằng sự phát triển của các khuẩn lạc trên môi trường có chứa kháng sinh ampicilin với nồng độ 100µ/ml. Trong môi trường chọn lọc, nếu có gen ngoại lai được gắn vào vector thì thấy xuất hiện các khuẩn lạc màu trắng trên đĩa thạch. Trên đĩa thạch nuôi cấy vi
khuẩn biến nạp, khuẩn lạc trắng được lựa chọn ngẫu nhiên để chọn lọc các dòng khả năng mang gen mong muốn và tiến hành tách chiết ADN plasmid. Các ADN plasmid sau khi tách chiết được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%.
2.1.2.3. Biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của Trypanosoma evansi
Để biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của tiên mao trùng sử dụng vector pET 32a (+). Với ưu điểm là có khả năng tạo số lượng lớn bản sao trong tế bào vật chủ, có promoter hoạt động mạnh, có gen kháng kháng sinh là chỉ thị để chọn lọc tế bào chứa plasmid tái tổ hợp, pET 32a (+) được sử dụng nhiều loại protein tái tổ hợp khác nhau trong biểu hiện ở mức độ cao của các gen ở vi khuẩn E.coli.
Plasmid pJET - RoTAT 1.2 chứa trình tự đoạn gen RoTAT 1.2 sau khi được tinh sạch sẽ được sử dụng trực tiếp để thực hiện phản ứng PCR khuếch đại gen RoTAT 1.2.
Gen RoTAT 1.2 và vector pET 32a (+) được cắt lần lượt với enzym
Bam HI rồi được điện di và tinh sạch bằng KIT Hing Pure Product purification KIT (Roche). Sau đó, sản phẩm tinh sạch tiếp tục được cắt với
Xho I. Sản phẩm xử lý enzym cuối cùng sẽ được tinh sạch và điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% trước khi thực hiện phản ứng ghép nối với nhau. Kết quả điện di là xuất hiện một băng duy nhất có kích thước tương tự như kích thước lý thuyết của gen và vector. Điều đó chứng tỏ, sản phẩm PCR sau khi cắt bằng hai enzym cắt giới hạn Bam HI và Xho I có chất lượng tốt.
Sản phẩm phản ứng ghép nối gen được biến nạp vào tế bào E.coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt và chọn lọc trên môi trường LB có bổ sung kháng sinh ampicilin với nồng độ 100µg/ml. Các khuẩn lạc trắng có khả năng chứa vector tái tổ hợp được lựa chọn để tách chiết plasmid và cắt bằng enzym cắt giới hạn. Plasmid tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào E.coli BL21(DE3)
bằng phương pháp sốc nhiệt và nuôi cấy trên đĩa LB có chứa kháng sinh Ampicilin ở 37ºC, qua đêm. Chủng vi khuẩn E.coli BL21(DE3)pLysS là chủng vi khuẩn mang những đặc tính di truyền đã được biến đổi thích hợp cho việc biểu hiện các protein tái tổ hợp từ nhóm vector pET. Chủng này còn mang plasmid pLysS mã hóa cho lyzozyme giúp kiểm soát chặt chẽ hơn cảm ứng biểu hiện protein tái tổ hợp so với chủng BL21(DE3) thông thường. Protein RoTAT 1.2 được biểu hiện ở dạng dung hợp đầu C với đoạn 6xHis. Sự biểu hiện protein RoTAT 1.2 trong E.coli BL21(DE3) bước đầu được phân tích bằng phương pháp SDS -PAGE và tiếp theo là Western blot.
Các dòng tế bào E.coli BL21(DE3) mang vector tái tổ hợp pET 32a/RoTAT 1.2 thu từ đĩa nuôi cấy rồi tiến hành nuôi cấy lắc trong môi trường lỏng LB có chứa ampicilin 100µg/ml, ở 37ºC qua đêm đến pha ổn định. Từ dịch nuôi cấy ổn định này, vi khuẩn lại tiếp tục được cấy chuyển sang môi trường LB lỏng có chứa kháng sinh ampicilin 100µg/ml, lắc trong khoảng 3 giờ để OD600 đạt từ 0,6 - 1 và bổ sung chất cảm ứng IPTG để đạt đến nồng độ cuối cùng là 1mM. Điều kiện cảm ứng IPTG là 37ºC trên máy lắc với tốc độ 200rpm trong 4 giờ. Đoạn gen mã hóa cho protein RoTAT 1.2 được chèn vào vùng MCS của vector pET 32a(+) và sự biểu hiện protein với sự kiểm soát của T7 promoter. Trên vector pET 32a(+) có chứa gen lacI mã hóa cho một protein ức chế gắn vào vùng operator lac trên promoter T7, ngăn cản sự phiên mã cho đến khi có sự cảm ứng bởi IPTG. Ptotein RoTAT 1.2 sẽ được biểu hiện theo cơ chế kiểm soát âm của hệ thống operon lac khi chất cảm ứng IPTG được bổ sung vào môi trường nuôi cấy.
Để khẳng định chắc chắn khả năng biểu hiện của gen RoTAT 1.2, tiến hành phản ứng Western blot với kháng thể đặc hiệu kháng T.evansi và kháng thể đặc hiệu kháng 6xHis. Protein RoTAT 1.2 sau khi được phân tích trên gel polyacrylamide, chuyển sang màng nitrocellulose rồi cho phản ứng với kháng
thể đặc hiệu và sau đó được gắn với protein A gắn peroxidase, hiện màu bằng TMB. Như vậy, kháng nguyên RoTAT 1.2 của tiên mao trùng T.evansi ở vi khuẩn E.coli BL21(DE3) đã được biểu hiện thành công.
2.1.2.4. Phương pháp KIT CATT
* Nguyên lý hoạt động KIT
Kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 được phủ trên bề mặt của hạt latex sẽ kết hợp đặc hiệu với kháng thể đặc hiệu Trypanosoma evansi để tạo thành các đám ngưng kết có thể quan sát bằng mắt thường.
* Thành phần của KIT:
- Tube màu vàng: chứa 1,5 ml kháng nguyên RoTAT 1.2 phủ hạt latex - Tube màu xanh: chứa 1 ml huyết thanh âm tính chuẩn
- Tube màu đỏ: chứa 1 ml huyết thanh dương tính chuẩn đặc hiệu với Trypanosoma evansi
- Ống falcon chứa 20 ml dung dịch pha loãng huyết thanh: 1 ống - Card phản ứng: 3 card
- Que khuấy: 5 cái