Bệnh tiên mao trùng ở nước ta được phát hiện ra từ lâu và ở nhiều nơi trong nước cụ thể:
Năm 1902 đã phát hiện thấy ngựa ở Hà Tiên bị nhiễm bệnh TMT.
Năm 1903 tìm thấy Trypanosoma evansi trong máu ngựa ở Nha Trang, năm 1904 thấy ngựa ở Vinh bị mắc, đến năm 1991 ngựa ở Thái Nguyên mắc bệnh tiên mao trùng.
Sau đó cũng có nhiều nhà nghiên cứu về tiên mao trùng ở Việt Nam cho rằng: bệnh tiên mao trùng đã gây thiệt hại nghiêm trọng cho đàn trâu, bò ở các tỉnh phía Bắc, đặc biệt là trâu, bò chuyển từ miền núi về đồng bằng trong các vụ Đông – Xuân.
Lê Ngọc Mỹ và cs (1994) [21] đã điều tra tình hình nhiễm tiên mao trùng ở trâu, bò Việt Nam. Kết quả cho thấy: trâu, bò nhiễm tiên mao trùng với tỷ lệ cao (21,27%), trong đó trâu, bò nuôi ở các tỉnh miền núi phía Bắc nhiễm Trypanosoma evansi cao hơn đồng bằng.
Theo Lê Đức Quyết và cs (1995) [25], trâu ở một số tỉnh miền Nam và Tây Nguyên nhiễm tiên mao trùng là 22,12%; bò là 6,6 – 10,3%.
Phan Lục và cs (1996) [19] cho biết, tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng của bò ở một số địa phương miền Bắc là 5,9%. Khi nghiên cứu tình hình nhiễm đơn bào ở một số tỉnh ở miền Trung và đồng bằng phía Bắc Việt Nam thấy, tỷ lệ nhiễm
trypanosoma evansi ở trâu là 28,8%, ở bò là 9,9%. Trong đó, trâu dưới 2 tuổi nhiễm 2,8%,từ 2 – 8 tuổi nhiễm 30,7% và trên 8 tuổi nhiễm tới 40,3%; bò dưới 2 tuổi nhiễm 1,5% từ 2 – 8 tuổi nhiễm 11,5% và bò trên 8 tuổi nhiễm 28%.
Theo Hoàng Thạch và cs (1996) [27], nghiên cứu về tình hình nhiễm tiên mao trùng của trâu và bò ở khu vực phía Nam cho biết: với 1830 mẫu nghiên cứu tại các tỉnh Sông Bé, Đồng Nai, Lâm Đồng, Long An và Thành Phố Hồ Chí Minh phát hiện 146 mẫu nhiễm tiên mao trùng, chiếm tỷ lệ 7,97% trong đó tỷ lệ nhiễm của trâu là 9,98% và bò là 12,60%.
Theo Hà Viết Lượng (1998) [20], tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở các tỉnh miền Trung là 8,99%.
Phan Địch Lân (2004) [17] đã tổng hợp kết quả điều tra 3172 trâu ở các tỉnh đồng bằng: trâu dưới 3 năm tuổi nhiễm thấp nhất (3,2 - 6,1%), trâu 3 - 5 tuổi nhiễm cao hơn (10,6 - 12,7%), trâu 6 - 8 tuổi nhiễm cao nhất (12,9 - 14,8%), trâu trên 9 năm tuổi tỷ lệ nhiễm giảm thấp hơn trâu 3 - 8 năm tuổi. Theo Phạm Văn Chinh (2006) [3], tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng cao nhất ở 4 - 8 năm tuổi (trâu: 12,71%; bò: 5,77%), thấp nhất là trâu bò dưới 3 năm tuổi (6,92% và 2,31%).
Bệnh tiên mao trùng được rất nhiều các nhà khoa học nghiên cứu và tìm hiểu tới. Theo các tác giả Trypanosoma evansi là nguyên nhân gây bệnh ở hầu hết các nước thuộc Bắc Phi, Trung Đông dọc theo Ấn Độ tới gần lục địa Châu Âu tới Châu Á.
Năm 1880, Laveran là người đầu tiên phát hiện Trypanosoma evansi trong máu lạc đà ở bang Punjab (Ấn Độ).
Năm 1885, Steel phát hiện ký sinh trùng này trong máu la ở Miến Điện, mô tả đặc điểm hình thái và đặt tên là Trypanosoma evansi.
Năm 1886 Blanchard cũng tìm thấy Trypanosoma evansi trong máu la nhập nội vào Bắc Bộ Việt Nam và mô tả các bệnh ở la, ngựa, bò.
Năm 1901, Forde phát hiện Trypanosoma gambiense và đến năm 1907 Chagas phát hiện Trypanosoma cruizi.
Năm 1893, Smith và Kilborne đã nghiên cứu về vai trò truyền bệnh của ve trong bệnh tiên mao trùng.
Ở Trung Quốc, cho biết Trypanosoma evansi gây bệnh cho hầu hết các loài động vật như trâu, bò, ngựa, la, chó…
Nghiên cứu về tỷ lệ nhiễm bệnh Trypanosomiasis, nhiều tác giả đã đưa ra những con số cụ thể:
Năm 1992, Tperone M. C. và cs (1992) [43] đã kiểm tra bò ở Venezuela thấy: bò dưới 3 tháng tuổi nhiễm Trypanosoma evansi 13% và bò trên 36 tháng tuổi nhiễm 50%.
Theo Sukanto I. P. và cs (1992) [41]: tỷ lệ lưu hành bệnh tiên mao trùng ở trâu Indonesia cao hơn ở bò và tỷ lệ nhiễm bệnh ở bò cao hơn ở ngựa.
Theo Simukoko H. và cs (2007) [39], nghiên cứu về dịch tễ bệnh tiên mao trùng ở các vật nuôi như: bò, lợn và dê ở Đông Zambia cho thấy: với 734 bò nghiên cứu phát hiện tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng là 13,5%; trong đó với 324 lợn nghiên cứu, các tác giả phát hiện chỉ có 0,9% trong số đó bị nhiễm; với 33 dê nghiên cứu, các tác giả chưa phát hiện được tiên mao trùng.
Sinshaw A. và cs (2006) [40] cho biết, nghiên cứu về tỷ lệ nhiễm
Trypanosoma vivax ở 3 khu vực Ethiopia cho thấy: bò nhiễm 6,1%, trong đó mùa mưa nhiễm 9,6%, mùa khô nhiễm 3,6%. Tác giả phát hiện 1/122 mẫu máu cừu có tiên mao trùng, chiếm 0,81%; còn đối với dê, tác giả thông báo có 1/676 mẫu nhiễm, chiếm tỷ lệ là 0,14%.
Phần 3
ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- KIT CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng chế từ kháng nguyên tái tổ hợp.
3.1.2. Vật liệu nghiên cứu
- KIT CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng chế từ kháng nguyên tái tổ hợp. - Huyết thanh trâu, bò để chẩn đoán bệnh.
3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.2.1. Địa điểm nghiên cứu
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Khoa Chăn nuôi thú y - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
3.2.2. Thời gian nghiên cứu
Từ ngày 09/6/2014 đến ngày 24/11/2014.
3.3. Nội dung nghiên cứu
3.3.1. Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của KIT CATT chẩn
đoán bệnh tiên mao trùng chế từ kháng nguyên tái tổ hợp
- Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của KIT chế từ kháng nguyên tái tổ hợp. - Xác định độ ổn định của KIT chế từ kháng nguyên tái tổ hợp.
3.3.2. Xác định điều kiện bảo quản của KIT CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng chế từ kháng nguyên tái tổ hợp mao trùng chế từ kháng nguyên tái tổ hợp
- Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản đến độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của KIT.
- Xác định ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của KIT.
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Phương pháp xác định độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của KIT CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng chế từ kháng nguyên tái tổ hợp CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng chế từ kháng nguyên tái tổ hợp
* Phương pháp lấy mẫu huyết thanh trâu để chẩn đoán bệnh
Lấy mẫu máu trâu cần kiểm tra cho vào ống nghiệm, để nghiêng ống nghiệm sao cho diện tích bề mặt máu rộng tối đa. Cố định ống nghiệm cho đến khi máu đông, dựng thẳng ống nghiệm lên để ở nhiệt độ thường hoặc trong tủ ấm 37ºC, khi thấy ra nhiều huyết thanh thì bỏ ống nghiệm vào tủ lạnh ở nhiệt độ 4 - 6ºC trong 2 - 3 tiếng để máu co lại và chắt lấy huyết thanh. Sau khi chắt được huyết thanh, lấy huyết thanh li tâm 1000 vòng/phút để loại bỏ hồng cầu. Bảo quản huyết thanh ở - 20ºC.
* Phương pháp sử dùng KIT CATT
- Bước 1: Chuyển KIT về nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.
- Bước 2: Dùng micropipet lấy 0,5 ml dung dịch pha loãng huyết thanh vào ống eppendorf.
- Bước 3: Lấy 0,1 ml huyết thanh cần chẩn đoán trộn đều vào ống eppendorf có chứa dung dịch pha loãng huyết thanh.
- Bước 4: Nhỏ lên các ô tròn trên card phản ứng, mỗi ô (10 µ l) kháng nguyên.
- Bước 5: Nhỏ các mẫu huyết thanh cần chẩn đoán (đã chuẩn bị ở bước 3), huyết thanh dương tính chuẩn, huyết thanh âm tính chuẩn vào các ô đã gắn kháng nguyên.
- Bước 6: Dùng que khuấy, trộn đều kháng nguyên và kháng thể. Sau (3 – 5 phút) đọc kết quả dựa trên sự hình thành đám ngưng kết:
+ Có hiện tượng ngưng kết: Dương tính (+) + Không có hiện tượng ngưng kết: Âm tính (-)
* Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của KIT
Các mẫu huyết thanh dương tính và âm tính với TMT của trâu được sử dụng để thực hiện xác định độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của KIT.
+ Độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng được xác định theo bảng và công thức dưới đây:
Kết quả Nhiễm TMT Không nhiễm TMT Tổng số
Xét nghiệm (+) A b a + b
Xét nghiệm (-) C d c + d
Tổng số a + c b + d N (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Công thức tính độ nhạy, độ đặc hiệu như sau: Độ nhạy của phản ứng (Se) = a/a + c
Độ đặc hiệu của phản ứng (Sp) = d/b + d
+ Độ ổn định của KIT được xác định trên 10 mẫu huyết thanh được lấy ngẫu nhiên, kháng thể đặc hiệu với TMT trong các mẫu huyết thanh này được xác định bằng KIT chế tạo với cùng các điều kiện thực hiện. Lặp lại phản ứng 5 lần. Chấm điểm ngưng kết của tất cả các lần phản ứng, xác định hệ số biến động (coefficient of variation - CV). Hệ số biến động càng nhỏ thì độ ổn định của KIT càng cao.
Dưới đây là bảng chấm điểm ngưng kết giữa kháng nguyên và kháng thể trên bảng CATT chế từ kháng nguyên tái tổ hợp dựa trên thang điểm từ âm tính (-), nghi ngờ (+/-) và 1+, 4+ (hình 4.2).
Hình 3.1: Đánh giá kết quả sử dụng KIT CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng
Mẫu âm tính: được chấm từ 0 đến 49 điểm tùy thuộc vào mức độ xuất hiện các chấm ngưng kết.
Mẫu nghi ngờ: quy ước là 50 điểm.
Mẫu dương tính: 1+ (60 điểm), 2+ (70 điểm), 3+ (80 điểm), 4+ (90 đến 100 điểm).
3.4.2. Phương pháp xác định điều kiện bảo quản KIT theo nguyên lý CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 chẩn đoán bệnh tiên mao trùng từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2
Để xác định điều kiện bảo quản KIT thích hợp, không làm ảnh hưởng đến chất lượng của KIT, chúng tôi tiến hành bảo quản KIT ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau và xác định độ nhạy, độ đặc hiệu, độ ổn định của KIT tại các thời điểm khác nhau. Từ đó, xác định điều kiện phù hợp nhất để bảo quản KIT.
3.5. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thu được, được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học (Theo tài liệu của Nguyễn Văn Thiện, 2008), và phần mềm Minitab 14.0
- Số trung bình cộng:
n X X=∑
Trong đó: ∑X: Tổng các giá trị của X
n: Dung lượng mẫu - Độ lệch tiêu chuẩn: + Với n > 30: 1 ) ( 2 2 − − ± = ∑ ∑ n n X X SX
- Sai số của số trung bình (với n ≤ 30)
1 − ± = n S m X X Trong đó: X
m : Sai số của số trung bình
X
S : Độ lệch tiêu chuẩn
- Hệ số biến động: Cv = ×100% x S Trong đó: Cv: hệ số biến động S: độ lệch tiêu chuẩn x: số trung bình cộng
Phần 4
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
4.1. Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của KIT CATT trước khi bảo quản khi bảo quản
4.1.1. Kết quả xác định độ nhạy độ đặc hiệu của KIT CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng chế từ kháng nguyên tái tổ hợp bệnh tiên mao trùng chế từ kháng nguyên tái tổ hợp
Các mẫu huyết thanh dương tính và âm tính với TMT của trâu, bò được sử dụng để thực hiện xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của KIT. Chúng tôi sử dụng 60 mẫu huyết thanh trâu thí nghiệm, trong đó có: 23 mẫu dương tính với tiên mao trùng đã được kiểm tra bằng phương pháp tiêm truyền chuột, 37 mẫu huyết thanh trâu âm tính với tiên mao trùng và kiểm tra huyết thanh âm tính với tiên mao trùng trong 1 tháng. Kết quả phản ứng CATT được thể hiện trong bảng 4.1.
Bảng 4.1: Kết quả xác định độ nhạy độ đặc hiệu của KIT CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng
Kết quả Nhiễm TMT Không nhiễm TMT Tổng số (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Xét nghiệm (+) 21 2 23
Xét nghiệm (-) 2 35 37
Tổng số 23 37 60
Từ 60 mẫu huyết thanh trâu, bò: có 23 mẫu dương tính với phản ứng CATT khi sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 và tương tự, trong 37 mẫu âm tính với tiên mao trùng, có 2 mẫu dương tính với phản ứng CATT khi sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2. Kết quả trên cho phép phát hiện độ nhạy của phản ứng (Se) là 91,30%, độ đặc hiệu của phản ứng (Sp) là 94,59%.
Kết quả ở bảng 4.1 cho thấy, với độ nhạy, độ đặc hiệu cao KIT CATT có thể chẩn đoán và cho kết quả chính xác trâu, bò khi mắc bệnh tiên mao trùng.
4.1.2 Kết quả xác định độổn định của KIT CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng chế từ kháng nguyên tái tổ hợp trùng chế từ kháng nguyên tái tổ hợp
Trong phản ứng này, chúng tôi đã lấy 10 huyết thanh trâu đã có sẵn được xác định là dương tính với phải ứng CATT. Mỗi mẫu huyết thanh được thử nghiệm đánh giá lặp lại 5 lần, chấm điểm ngưng kết của từng lần để đánh giá độ ổn định của KIT.
Chấm điểm ngưng kết bằng cách, đánh giá mức độ ngưng kết giữa kháng nguyên phủ lên hạt latex và kháng thể trong mỗi lần thử dựa vào thang điểm đã được quy ước (như hình 3.1).
Độ ổn định của KIT đánh giá dựa trên mức độ phân tán (Cv%) (hệ số biến dị), Cv càng lớn thì mức độ biến dị càng nhiều hay, nói cách khác thì Cv càng nhỏ thì cho kết quả độ ổn định của KIT càng cao.
Kết quả chấm điểm ngưng kết được trình bày trong bảng sau:
Bảng 4.2: Kết quả chấm điểm ngưng kết để xác định độ ổn định của KIT CATT trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng
Mẫu Lần phản ứng X(điểm) Cv (%) 1 2 3 4 5 1 90 90 95 95 95 93,0 2,94 2 90 92 90 90 90 90,4 0,09 3 90 95 90 95 95 93,0 2,94 4 90 90 80 90 90 88,0 5,08 5 98 95 95 95 95 95,6 1,40 6 88 88 88 80 88 86,4 4,14 7 92 92 92 92 90 91,6 0,98 8 90 90 90 90 90 90,0 0 9 85 85 82 85 85 84,4 1,59 10 80 80 80 80 80 80,0 0
Từ kết quả ở bảng 4.2 cho thấy, hệ số biến động của của mỗi mẫu chênh lệch không đáng kể sau các lần phản ứng. Dao động từ 0% đến 5,80%, đây là mức độ biến động thấp, tương ứng với độ ổn định của KIT đạt mức độ cao vậy ứng dụng KIT CATT trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho trâu, bò, mang lại hiệu quả và mức độ chính xác cao.
4.2. Kết quả nghiên cứu điều kiện bảo quản KIT
Bệnh tiên mao trùng do loài Trypanosoma evansi gây ra những hậu quả lớn đối với đàn gia súc ở nước ta, đặc biệt là trâu, bò ở miền núi nơi điều kiện kinh tế khó khăn, sự hiểu biết của người dân còn hạn chế. Vì vậy công tác chẩn đoán chính xác gia súc bị bệnh là rất quan trọng. Việc chế tạo KIT dạng CATT đã đáp ứng được tốt công việc chẩn đoán bệnh tiên mao trùng trên trâu, bò. KIT CATT chẩn đoán bệnh đơn giản, ít chi phí và mang lại hiệu quả nhanh, nhạy. Nhưng muốn giữ cho KIT không bị hư hỏng thì việc bảo quản là điều đáng được quan tâm, để có thể đưa ra những điều kiền thích hợp nhất nhằm có các khuyến cáo cho người sử dụng. Trong đề tài này chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm bảo quản KIT ở 2 mức nhiệt độ là 0oC và ở nhiệt độ phòng thời gian bảo quản trong vòng 6 tháng.
4.2.1. Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản đến độ nhạy, độđặc hiệu và độổn định của KIT (sau 1 tháng bảo quản) và độổn định của KIT (sau 1 tháng bảo quản)
Để giữ cho KIT CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng trên trâu bò không bị hư hỏng trong thời khoảng thời gian nhất định, chúng tôi tiến hành bảo quản KIT CATT ở nhiệt độ 0o
C và ở nhiệt độ phòng trong thời gian 1 tháng. Sau 1 tháng bảo quản, kiểm tra KIT trên trên với 60 mẫu huyết thanh trâu, trong đó có 23 mẫu dương tính với phản ứng CATT sử dụng kháng